人参皂甙Rb1对机械通气大鼠肺组织NF-κB和iNOs表达的影响

单鸳露 王良荣 叶玉柱 胡正杨

机械通气被广泛应用于临床，用于重症患者和手术患者的生命支持，但机械通气也会诱发加重肺损伤，即机械通气肺损伤（ventilator-induced lung injury，VILI）。研究表明，不合理的机械通气尤其是大潮气量机械通气引起肺泡过度膨胀，造成肺组织气压伤和容积伤，破坏肺屏障功能，最终致炎症介质的释放引起生物伤[1-2]。人参皂甙Rb1是人参中有效单体成分之一，具有多种药理作用，包括抗炎、抗氧化、抗凋亡等作用[3]。本研究建立大鼠VILI模型，拟观察人参皂甙Rb1对大潮气量机械通气大鼠肺组织炎症和相关通路蛋白的影响，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 实验动物与分组 SPF级成年雄性SD大鼠30只，体重300～350g[温州医科大学实验动物中心提供，许可证编号：SYXK（浙）2010-0150]，动物实验前禁食12h，自由饮水。采用随机数字法分为假手术组（C组）、VILI组和人参皂甙Rb1预处理组（Rb1组），每组10只。

1.2 主要试剂及仪器 人参皂甙Rb1（上海源叶生物科技有限公司）；TNF-α、IL-6 ELISA试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）；NO试剂盒（南京建成生物工程研究所）。Trizol提取液（美国Life technologies公司）；逆转录试剂盒、PCR试剂盒（美国Fermentas Life Science公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（中国碧云天生物技术研究所）；兔抗大鼠NF-κB多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗IgG，细胞质内参GAPDH（英国Abcam公司）；HX-300小动物呼吸机（成都泰盟有限公司）；酶标仪（美国Thermo公司）；垂直电泳系统（美国BIO-RAD公司）；显微镜（日本Olympus公司）。

1.3 VILI模型的建立 3组大鼠予腹腔注射20%乌拉坦8ml/kg麻醉，暴露左股静脉并置管用于输液和给药，暴露气管，切开气管。VILI组及Rb1组大鼠静脉注射维库溴铵（浙江仙居药业）6mg/kg阻断自主呼吸，并予气管内插入自制气管导管，接HX-300小动物呼吸机进行机械通气4h，建立VILI模型。通气参数设定：潮气量40ml/kg，呼吸频率60次/min，吸呼比2∶3。Rb1组于机械通气前30min静脉注射人参皂甙Rb1 40mg/kg，C组和VILI组给予等容量0.9%氯化钠溶液。C组气管切开后保留自主呼吸，未予机械通气。

1.4 标本采集及指标检测 4h后3组大鼠予颈动脉放血处死，迅速取出心脏和肺，结扎右肺门，4℃0.9%氯化钠溶液左肺支气管肺泡灌洗3次，收集肺泡灌洗液（BALF）5ml，并在 4℃下以 2 000r/min 离心10min，取上清液-70℃冻存待测，采用ELISA法测定BALF中TNF-α、IL-6水平，硝酸盐还原酶法检测NO水平。

1.5 肺组织湿/干重比（W/D）测定 取右肺上叶，用滤纸吸干肺组织表面水分称重后为湿重（W），置于70℃恒温电热鼓风干燥箱72h至恒重再称重为干重（D），计算肺组织W/D，以反映肺水肿程度。

1.6 肺组织病理变化 右肺中叶于10%多聚甲醛中固定，常规脱水，包埋，切片，HE染色，光镜下观察肺组织病理学变化，主要观察有无肺水肿、肺泡与肺间质炎症、肺泡及间质出血，肺泡隔增厚程度及透明膜的形成。

1.7 肺组织诱导型一氧化氮合酶（iNOs）mRNA的检测剩余左肺组织取50mg置于研钵加液氮研磨，用Trizol萃取总RNA，进行RT-PCR对扩增产物进行半定量分析，iNOs引物序列正链 5′-TAG AGG AAC ATC TGG CCA GG-3′反链 5′-TGG CCG ACC TGA TGT TGC CA-3′扩增产物大小为255bp，内参GAPDH引物序列正链5′AAC CCA TCA CCA TAT TCC AGG AGC-3′，反链 5′CAC AGT CTT CTG AGT GGC AGT GAT-3′，扩增产物大小350bp。RT-PCR循环参数设置：预变性95℃，5min；变性 95℃，30s；退火 57℃，30s；延伸 72℃ 30s；循环33次，1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶图像分析系统进行分析，以目的基因扩增产物灰度值与内参GAPDH扩增产物灰度值的比值来表示基因表达水平。

1.8 肺组织NF-κB的测定 采用Western blot检测。依照试剂盒说明书提取胞核蛋白，采用BCA法测定浓度。蛋白在10%SDS-PAGE中室温电泳分离，300mA、70min湿转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2h，加一抗 NF-κB（稀释度 1∶2000）抗体和 GAPDH（稀释度1∶500）抗体，4℃孵育过夜，加入生物素标记的羊抗兔IgG二抗室温孵育1h，ECL化学发光法进行检测，胶片扫描拍摄图像并进行半定量分析，采用Image J测定目的条带的吸光度值，并以目的蛋白和相应内参的吸光度值比值表示目的条带相对强度。

1.9 统计学处理 采用SPSS 15.0统计软件。计量资料采用表示，组间比较采用单向方差分析，方差齐性者两两比较采用LSD-t检验，方差不齐者采用Dunnet′t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.13 组大鼠肺BALF中TNF-α、IL-6、NO水平及肺组织W/D的比较 与C组相比，VILI组和Rb1组BLAF中 TNF-α、IL-6、NO 水平均升高（均P＜0.05）；与 VILI组比较，Rb1组TNF-α、IL-6、NO水平均下降（均P＜0.05）。与C组比较，VILI组和Rb1组肺组织W/D比值升高（P＜0.05）；与VILI组比较，Rb1组肺组织W/D比值降低（P＜0.05）。见表 1。

表1 3组大鼠BALF中TNF-α、IL-6、NO水平及肺组织W/D的比较

2.2 3组大鼠肺组织光镜下显微结构改变 光镜下C组无明显肺损伤，肺部无水肿，肺泡隔均一、结构清晰（图1a，见插页），VILI组可见明显的肺间质及肺泡内渗出水肿，肺间质内可见大量炎性细胞浸润，肺泡隔增宽，局灶的肺泡塌陷和肺不张，部分出现肺大泡（图1b，见插页）；Rb1肺组织损伤程度较VILI组缓解，肺泡隔轻度增宽，炎性细胞浸润程度较VILI组明显减轻（图1c，见插页）。

图1 3组大鼠肺组织光镜显微结构变化（a：C 组；b：VILI组；c：Rb1组；HE 染色，×200）

2.3 3组大鼠肺组织iNOs mRNA表达情况 与C组相比，VILI组和Rb1组肺组织iNOs mRNA表达增高（P＜0.05）；与VILI组比较，Rb1组肺组织iNOs mRNA表达降低（P＜0.05）。见图2。

图2 3组大鼠肺组织iNOs mRNA表达（与C组比较，*P＜0.05；与 VILI组比较，△P＜0.05）

2.4 3组大鼠肺组织NF-κB蛋白表达情况 与C组相比，VILI组和Rb1组肺组织NF-κB蛋白表达增加，与VILI组比较，Rb1组肺组织NF-κB蛋白表达降低（P＜0.05）。见图 3。

图3 3组大鼠肺组织NF-κB蛋白表达（与C组比较，*P＜0.05；与 VILI组比较，△P＜0.05）

3 讨论

本次研究参照前期研究采用40ml/kg大潮气量机械通气4h建立大鼠VILI模型[4]，肺泡毛细血管通透性增加，炎性细胞浸润，肺组织含水量显著增加，证实VILI模型制备成功。而人参皂甙Rb1处理后机械通气大鼠肺组织病理损伤明显缓解，炎症因子释放减少，肺部微循环通透性损伤和肺水肿减轻。

研究表明，机械刺激（牵拉、剪切力）作用肺组织造成机械损伤，通过各种信号传导途径，触发促炎细胞因子释放和中性粒细胞的募集，形成瀑布级联效应，导致肺部炎症甚至全身炎症反应，即“生物伤”[5]。NF-κB作为炎症介质基因转录的核转录因子，在炎症反应中起关键作用，在氧化应激、细胞因子，脂多糖等多种刺激下，NF-κB的激活和IkB-α的磷酸化，促使NF-κB从胞质转移至胞核，调控多种促炎因子的转录，炎症因子（如TNF-α、IL-1β、IL-6等）、细胞黏附分子等表达增加，同时进一步刺激NF-κB的活化[6]。既往研究表明NF-κB信号通路的激活在VILI的发病中起重要作用[7-8]，Held等[9]研究通过离体肺伤害性机械通气证实过度通气可刺激细胞因子和趋化因子产生诱导炎症反应，导致NF-κB活化。本研究也证明VILI大鼠肺组织 NF-κB活性较对照组明显增加，炎症介质TNF-α、IL-6表达也显著增加，表明机械通气过程中NF-κB活化可能参与机械通气后肺组织中致炎细胞因子合成释放的调控过程。人参皂甙Rb1具有抗炎、抗细胞凋亡等药理作用。研究证明，Rb1通过抑制NF-κB的活性，改善肠缺血再灌注诱导的肝损伤[10]。同样研究证实，人参皂甙Rb1通过使炎症反应活性减弱和抑制NF-κB易位可显著改善TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞损伤[11]。本研究也发现Rb1预处理后，VILI大鼠的NF-κB活性降低，提示人参皂甙Rb1可能通过降低NF-κB活性，降低炎症因子的表达，减轻VILI。

NO作为一种重要的炎症介质，参与多种疾病发病过程[哮喘，急性肺损伤（ALI）和循环休克]，主要由一氧化氮合酶（NOs）催化产生。在病理状态下，由iNO催化产生大量的NO，不仅直接损伤组织细胞，还易产生氧自由基，并生成过氧亚硝酸阴离子（ONOO-），导致硝化应激和组织损伤。Peng等[12]研究发现小鼠大潮气量机械通气后iNOs表达显著增加，iNOs的表达改变及硝化应激的激活与肺毛细血管通透性增加相关，同时在iNOs基因敲除小鼠机械通气中，肺损伤加重，硝化应激和肺毛细血管通透性显著增加，更证明了iNOs在VILI中的直接作用。本研究结果表明大潮气量长时间通气后，大鼠肺组织iNOs转录活跃，NO表达增加，与上述研究结果一致。人参皂甙Rb1干预后，大鼠iNOs表达显著降低。有研究表明NF-κB的激活不仅可增加趋化因子和细胞因子，同样可增加iNOs的表达[13]。由此推断，在机械通气肺损伤大鼠，人参皂甙Rb1也可能通过降低NF-κB的活性，减少iNOs的表达，抑制促炎因子的释放。

综上所述，人参皂甙Rb1可降低NF-κB和iNOs的活性，减少炎性介质释放，减轻机械通气诱导肺损伤。