二苯甲酮衍生物对酪氨酸酶生物活性的影响*

刘 清，曾福燃，蒋汇锋，冯安生，邹训重，游 遨

广东轻工职业技术学院 生态环境技术学院，广州510300

酪氨酸酶是一种广泛分布于人、动物、植物以及菌类的含铜氧化酶，在结构上属于Ⅲ型金属酶[1，2]。酪氨酸酶与生物体内色素的生成有着直接关系，其在生物体内催化成L-酪氨酸生成L-多巴，进一步将L-多巴催化成L-多巴醌，最终多巴醌自我氧化生成黑色素[3]。人体内酪氨酸酶活性偏低将间接导致多种疾病，如白癜风、白化病以及神经退行性疾病等[4，5]。目前，用于治疗白癜风和白化病的药物大多来自中草药提取物，例如提取自何首乌的2，3，5，4'-四羟基芪-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（THSG）、提取自补骨脂和淫羊藿的补骨脂素、类黄酮、芹黄素等，而相关的化学合成药物报道较少[6，7]。

二苯甲酮衍生物广泛应用于现代工业，是一类重要的紫外吸收剂，主要应用于自由基紫外光固化清漆体系，如UV 涂料、UV 油墨等。还可用于防晒化妆品中的抗紫外线成分，以及用于医药行业生产苯乙烯聚合抑制剂以及各类香料的定香剂[8，9]。现选取了11 种二苯甲酮衍生物，测试其对酪氨酸酶活性的影响，发现部分二苯甲酮衍生物表现出优异的酪氨酸酶激活活性。这一发现为酪氨酸酶激活剂拓展了一个新的研究方向。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

2-羟基二苯甲酮、3-羟基二苯甲酮、4-羟基二苯甲酮、4-甲氧基二苯甲酮、3-甲基二苯甲酮、4-甲基二苯甲酮、4，4′-二羟基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二甲氧基二苯甲酮、4，4′-二氟二苯甲酮、3-甲氧基-4，4′-二羟基二苯甲酮（均购自上海麦克林生化科技有限公司）；蘑菇酪氨酸酶（比活力为6680 U·mg-1，购自美国Sigma 公司）；L-β-（3，4-二羟基）苯丙氨酸（L-DOPA，纯度99%，）、L-酪氨酸（均购自英国Alfa Aesar 公司）；其他试剂均为国产分析纯；水为去离子重蒸水。

UV-2501 紫外可见分光光度计（日本岛津公司）；BPZ11D 型电子天平（Sartorius）。

1.2 测试方法[5，10]

于1.5 mL 离心管中加入890 μL 磷酸缓冲溶液（pH=6.8），随后加入20 μL 不同浓度的化合物DMSO 溶液（控制DMSO 在体系中最终浓度为2%），然后加入10 μL 溶解于磷酸缓冲溶液的酪氨酸酶（浓度为0.5 mg·mL-1），摇匀，置于25 ℃恒温水浴10 min。向离心管内加入80 μL 的L-DOPA 溶液（浓度为2 mg·mL-1），迅速振荡摇匀，于25℃下进行测试。观察溶液在475 nm 波长下的吸光度值（A 值）变化，时间3 min。扣除缓冲溶液本身对试验的影响，根据A值增长曲线求出斜率，即为酶活力值。

酶的相对活性=K/K0×100%

K 为加入化合物时反应进程的直线斜率；

K0为不加化合物反应进程的直线斜率。

2 结果与讨论

2.1 11 种二苯甲酮衍生物对酪氨酸酶活性的影响

在本实验中，选取11 种二苯甲酮衍生物，测试其对酪氨酸酶的活性影响，结果见表1。所选化合物结构见图1。

表1 11 种二苯甲酮衍生物对酪氨酸酶活性的影响

测试结果显示，在选取的11 种二苯甲酮衍生物中，激活效果最好的两种分别为4-羟基二苯甲酮与3-羟基二苯甲酮。4-羟基二苯甲酮、3-羟基二苯甲酮、2-羟基二苯甲酮与4，4′-二羟基二苯甲酮这四种化合物均在较低的浓度范围内表现出强烈的酪氨酸酶激活活性，随着浓度逐渐增大，其对酪氨酸酶的激活效果逐渐降低。有趣的是，当2-羟基二苯甲酮浓度超过300 μmol·L-1后，其对酪氨酸酶的活性影响从激活转变为抑制。见图2。

2.2 4-羟基二苯甲酮和3-羟基二苯甲酮对酪氨酸酶激活动力学的机制

为进一步研究这类化合物对酪氨酸酶的激活机制，选取了其中活性最好的两种化合物4-羟基二苯甲酮和3-羟基二苯甲酮，通过测试做出Lineweaver-Burk 双倒数曲线。见图3。

如图3 所示，4-羟基二苯甲酮和3-羟基二苯甲酮对酪氨酸酶激活动力学曲线均为平行线，两组测试的最大速率（Vmax）和表观米氏常数（Kappm）均随着测试样品浓度增加而增大，根据Saboury AA 关于激活剂的理论[11]，表明两种化合物对酪氨酸酶激活动力学模式均为非竞争性。

2.3 化合物结构对其激活效应的影响

这类化合物均为二苯甲酮衍生物，它们具有相同的母体结构，但是取代基的位置、数量及取代基的差异对活性有很大的影响。

①羟基分别在4-位、3-位及2-位时，对酪氨酸酶的最大激活效率由230%降低到215%及162%。

②当化合物中羟基的数量增加时，其对酪氨酸酶的激活活性降低，4-羟基二苯甲酮对酪氨酸酶的最大激活率为230%，而4，4′-二羟基二苯甲酮仅为160%，当化合物中羟基的数量增加至3 个或者以上时，其对酪氨酸酶的影响由激活转变为抑制[12]。

③当化合物中的羟基被氨基取代之后，其对酪氨酸酶的激活活性大幅降低，如4-氨基二苯甲酮与3-氨基二苯甲酮对酪氨酸酶的最大激活率分别仅为147%和149%。

④这类化合物中的羟基被甲氧基、甲基或氟原子取代之后，其对酪氨酸酶的激活效果大幅度降低、甚至消失。

3 小 结

本实验选取了11 种二苯甲酮衍生物，分别研究了其对酪氨酸酶激活效果的影响，结果显示，大部分化合物对酪氨酸酶表现出良好的激活效果，其中活性最好的为4-羟基二苯甲酮，其对酪氨酸酶最大激活率达到230%。除此之外，取代基的位置、数量以及取代基本身的不同对这类化合物的活性都有很大影响。在接下来的研究中，将选取活性最好的4-羟基二苯甲酮和3-羟基二苯甲酮两种化合物进行体内活性测试。