不同抗凝剂对ADP诱导血小板活化影响的比较

税凤春，华晓东，徐 琳，芮 菁

(天津市药品检验研究院，天津 300070)

近年来，在血小板功能评价中，采用流式细胞术检测血小板活化生物标志物-膜糖蛋白的方法成为主流，与血小板聚集率检测等传统方法相比，该方法具有操作易规范化、过程简单、无需制备富血小板血浆、快速准确、更易量化等优点。但由于血小板在体外非常活跃，影响因素较多，如采血环节、抗凝剂使用不当等易造成自发活化率升高，然而目前国内有关血小板活化生物标志物检测影响因素研究报道少见。本文研究了不同抗凝剂对其影响作用，以期确定一个较好的标本抗凝方法。

1 材料与仪器

1.1受试物 五水枸橼酸钠(Na3C6H5O7·5H2O)，天津市赢达稀贵化学试剂厂，临用前用纯化水配制成3.8%浓度的溶液备用。EDTAK2采血管，批号 20160502，规格 0.5 ml，山东省成武县华博医疗器械有限公司；肝素钠采血管，批号 20170112，规格 1 ml，苏州灵岩医疗器械有限公司；3.2%枸橼酸钠采血管(1∶9)，批号 20170324，规格 1 ml，苏州灵岩医疗器械有限公司。

1.2试剂 Anti-Mouse/Rat CD62p PE/Cy7(P-selectin)，批号 B223759； Anti-Mouse/Rat CD61 PE，批号 B216420，均购自Biolegend。Rat IgG2a-PE/Cy7，批号 4290714；Rat IgG-PE，批号 4281135，均购自eBioscience。ADP，批号 SLBP6247V，SIGMA。 鞘液(Focusing Fluid)，批号 0316C225，Life Technologies Corporation。4%多聚甲醛，批号 6119851，Biolegend公司。多聚甲醛，批号 SZBG1160V，SIGMA。稀释液(Flow Cytometry Staining Buffer)，批号 6111151，联科生物。补偿微球(UltraComp eBeads)，批号 4312694，ThermoFisher。PBS (pH 7.2-7.4)，批号 16052302，无锡傲锐东源生物科技有限公司。

1.3实验动物 SD大鼠，SPF级，体重 200～300 g，雌雄兼用，雌鼠无孕。北京维通利华实验动物技术有限公司购进，许可证号：SCXK(京)2016-0001。在实验期间按国家对实验动物饲养条件要求进行饲养。

1.4仪器 流式细胞仪Attune NxT，ThermoFisher SCIENTIFIC；XS-205DU电子天平，精度0.1 mg，试剂称量用；XP2001S电子天平，精度 1 g，动物称量用； 5 ml、1 ml、200 μl、1～10 μl移液器及相应规格吸头；37 ℃恒温水浴、具塞小瓶、5 ml塑料流式管、1.5 ml EP管、玻璃毛细采血管、计时器、试管架等。

2 统计学处理

3 试验方法

3.1流式细胞检测方法 每只动物取抗凝血50 μl，测定血小板自发活化率；另取抗凝血50 μl，加入50 μl终浓度为10 μmol/L的ADP激活，再分别加入抗体CD62p PE/Cy7和CD61 PE各1.0 μl双标，以CD61标记所有血小板，以CD62p标记活化血小板。在4 ℃暗处孵育20 min后，各管加入0.5 ml 4%多聚甲醛PBS于4 ℃暗处固定10 min。分别取固定后的血样50 μl，加入1 ml稀释液稀释后上机分析，检测经ADP激活的血小板活化率。在CD61 PE/侧向角光散射(SSC)双参数散点图中划定血小板细胞群，计数5 000个血小板，进一步在CD61/CD62p散点图中计数CD61及CD62p阳性表达的细胞数，并以CD62p阳性表达率占CD61表达率的百分比反映血小板的活化率。

3.2不同抗凝剂对ADP激活血小板膜糖蛋白CD62p影响的比较 取SD大鼠18只，雌雄各半，250～300 g，分成枸橼酸钠组、肝素钠组和EDTAK2组，每组各6只，眼眶取血，置于不同抗凝采血管中制备抗凝血，按“3.1”项下方法检测CD62p表达率。

3.3不同浓度枸橼酸钠抗凝剂对ADP激活血小板膜糖蛋白CD62p影响的比较 取SD大鼠12只，雌雄各半，250～300 g，分成2组，3.2%枸橼酸钠抗凝组和自配3.8%枸橼酸钠抗凝组，每组6只，眼眶取血，置于不同抗凝采血管中制备抗凝血，按“3.1”项下方法检测CD62p表达率。

4 结果

4.1不同抗凝剂对ADP激活CD62p表达的影响 实验结果表明，在相同ADP激活条件下，EDTAK2管抗凝标本所测的CD62p表达率最低，枸橼酸钠抗凝稍高，肝素钠抗凝活化百分率最高。肝素钠抗凝能明显促进ADP激活CD62p的表达，同时使未用ADP处理过的样本CD62p的自发表达率明显高于文献报道的2%的基础值[1]；EDTAK2管标本在ADP激活后CD62p表达无明显的升高，与枸橼酸钠、肝素钠组之间有统计学意义(P<0.001)。结果见表1。

表1 不同抗凝剂对血小板活化的影响

4.2不同浓度枸橼酸钠抗凝对ADP激活CD62p表达的影响 在相同ADP激活条件下，采用3.2%枸橼酸钠抗凝和采用自配的3.8%枸橼酸钠抗凝，CD62p表达率无明显差异。结果见表2。

表2 不同浓度枸橼酸钠抗凝剂对血小板活化的影响

5 讨论

检测血小板功能的方法有多种，但常有争议，主要是由于影响因素较多造成结果的不稳定引起，如血样的收集、抗凝剂的选择、标本处理等因素，都可能导致体外血小板活化而影响结果的判定，最终影响其在科研、标准制定及临床诊断中的应用价值。全血法流式细胞术可用于血小板功能的检测，其是一种在分子水平通过观察活化标志物CD62p的表达来分析血小板活化的新方法，有许多优点[2]：需血量少，灵敏度高，特异性好，避免了体外血小板激活和丢失，不需要分离血小板，因而减少了制备过程中人为活化的干扰因素等。因此，流式细胞术检测血小板膜糖蛋白分子表达水平越来越多地应用在临床诊断乃至药物活性评估中。CD62p又称血小板活化依赖α颗粒膜蛋白，血小板表面CD62p的表达能够准确反映血小板活化程度[3,4]。流式细胞术检测血小板表面CD62p的表达是目前文献报道最多的血小板活化生物标志物检测方法[5]。其特异性得到广泛认可，在临床诊断、药物活性评价等环节中应用前景广泛，因此更需要排除各种影响因素的干扰，以获得稳定可靠的测定结果。

现代临床研究证明，中医血瘀证患者存在血小板活化现象[6]。血小板活化生物标志物CD62p的特异性良好，非常适用于活血化瘀药物的活性评价，并可将其引入药物的质量标准中。由于活血化瘀药物是抑制血小板活化，因此必须在给药的同时加入激动剂ADP，以此获得CD62p的高表达，在此基础上评估药物的活性，所有的检测操作环节都不能对其造成不良影响。为了加强血小板活性测定方法的质量控制，本文研究了不同抗凝剂对流式细胞术检测CD62p表达的影响。

血小板活化的最主要表现是黏附与聚集，为防止血样采集阶段出现凝血现象对后续检测造成影响，需选择合适的抗凝剂进行抗凝。枸橼酸钠(柠檬酸钠)与血液中的钙离子形成可溶性的螯合物，使Ca2+失去凝血作用，阻止血液凝固；肝素钠通过与抗凝血酶结合，增强抗凝血酶的作用，灭活丝氨酸蛋白酶，阻止凝血酶的形成和血小板聚集，从而阻止血液凝固；EDTAK2与血液中的钙离子结合形成配位化合物，阻止血凝。

血小板聚集是判断血小板功能的金标准，在先天性和获得性血小板疾病诊断中很有价值[7]，而Ca2+是血小板聚集所必需。本研究结果显示：肝素钠抗凝使自发活化率明显高于文献报道的2%的基础值，而自发活化率升高对ADP激活率有影响。EDTAK2抗凝因钙被络合过多而致血小板不聚，ADP激活率明显低于肝素钠与枸橼酸钠组。因此肝素钠和EDTAK2绝对不能作为流式细胞术测CD62p的抗凝剂。

综上所述，不同抗凝剂对流式细胞术检测血小板膜糖蛋白表达均有不同程度的影响，枸橼酸钠是流式细胞术测血小板膜糖蛋白的最佳抗凝剂。