糖肾康胶囊的质量标准研究

黄 涛

(天津市儿童医院，天津 300134)

由于糖尿病肾病的病因病机还未搞清楚，因此西医针对这一疾病的治疗疗效总是不够理想，而中药复方具有多靶点、多途径和多层次的综合治疗优势，在临床上多有用于糖尿病肾病方面的治疗，疗效肯定[1]。因此，为满足临床应用需求，及时开发针对糖尿病肾病治疗的有效中药新药势在必行。糖肾康胶囊处方是来源于老中医临床经验方，由丹参、黄连、知母、水蛭、黄芪和淫羊藿等药材组成，临床应用时制备成汤剂，用于治疗糖尿病肾病，应用多年，疗效可靠。为了掩盖苦味、便于服用，考虑患者的顺应性，拟将其制成胶囊剂。其制备工艺为：黄连用乙醇单独提取，淫羊藿等6味药材采用水提醇沉工艺，分别制得干燥浸膏粉，混合后加辅料湿法制粒并装0#胶囊。本研究采用薄层色谱法(TLC)进行定性鉴别，分别鉴别了该制剂中的丹参、知母和黄芪；运用高效液相色谱法进行含量测定，选择的指标成分是处方中君药淫羊藿的主要化学成分淫羊藿苷，以为建立糖肾康胶囊的质量控制标准提供参考。

1 仪器与试药

DIONEX Ultimate型3000高效液相色谱仪(美国DIONEX公司)；AUY220型万分之一电子分析天平(日本Shimadzu公司)；AB135-S型十万分之一电子分析天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；BUG25-06型超声波清洗仪(上海必能信超声有限公司，功率：250 W，频率：25 kHz)；Diamonsil C18色谱柱(200 mm×4.6 mm，5 μm，迪马科技有限公司)；高效硅胶G板；乙腈、甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。菝葜皂苷元对照品(批号110744-200509，纯度：95%)、丹酚酸B对照品(批号110532-201212，纯度>98%)、黄芪甲苷对照品(批号113791-200613，纯度>98%)、淫羊藿苷对照品(批号113717-200415，纯度>98%)、知母对照药材(批号120170-200503)、丹参对照药材(批号123823-201414)、黄芪对照药材(批号113681-200613)均购自中国食品药品检定研究院。实验所用药材均购自安国长安中药材有限公司，经天津药物研究院中药现代研究部张铁军研究员鉴定，符合《中国药典》2015年版一部要求。糖肾康胶囊(批号120803，120804，120805)为自制样品。各药味的阴性样品均由除该药味以外的其他药味按原处方、工艺制备。

2 方法与结果

2.1定性鉴别

2.1.1丹参 称取经研细的糖肾康胶囊内容物1.0 g，加10 ml无水乙醇，加稀盐酸调pH至2～3，超声(功率：250 W，频率：25 kHz)处理20 min，滤过，取续滤液作为供试品溶液。另取适量的丹酚酸B对照品，加甲醇溶解并定容，制备质量浓度为1 mg/ml的丹酚酸B对照品溶液。另取丹参对照药材过4号筛的细粉0.5 g，加25 ml甲醇，超声处理10 min，滤过，取续滤液作为对照药材溶液。按处方工艺和比例制备缺丹参的阴性样品，称取阴性样品1.0 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按2015年版《中国药典》四部[2]TLC法试验，分别吸取以上4种溶液各10 μl，点到同一张硅胶G薄层板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲苯-甲醇-甲酸(3∶4∶2∶0.5∶2)为展开剂进行展开，取出薄层板，于通风橱中晾干，喷以3%FeCl3乙醇溶液显色，置日光灯下检视。结果在与对照品和对照药材薄层色谱的相应位置上，各供试品色谱显相同颜色的蓝色斑点，阴性样品色谱无干扰。见图1。

1.阴性对照 2.对照品 3.对照药材 4～6.供试品

2.1.2知母 称取经研细的本品内容物2.0 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，加甲醇30 ml，超声处理30 min，过滤并蒸干滤液，残渣加水20 ml使溶解，溶液中加盐酸2 ml并摇匀；再加10 ml甲苯，水浴中加热回流提取1 h，自然冷却；分取甲苯层并蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取适量的菝葜皂苷元对照品，加三氯甲烷溶解并定容，制备质量浓度为0.5 mg/ml的菝葜皂苷元对照品溶液。另取知母对照药材细粉(过4号筛)1.0 g，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按处方工艺和比例制备缺知母的阴性样品，称取阴性样品2.0 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按2015年版《中国药典》四部[2]TLC法试验，分别吸取以上4种溶液各10 μl，点到同一张硅胶G薄层板上，以丙酮-环己烷-冰醋酸(1∶9∶0.2)为展开剂进行二次展开，取出薄层板，于通风橱中晾干，喷显色剂[8%香草醛无水乙醇-10%硫酸(1∶1)的混合溶液]，于105 ℃烘至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果在与对照品和对照药材薄层色谱的相应位置上，各供试品色谱显相同颜色的黄色斑点，阴性样品色谱无干扰。见图2。

1.阴性对照 2.对照品 3.对照药材 4～6.供试品

2.1.3黄芪 称取经研细的本品内容物3.5 g，加30 ml甲醇，冷浸过夜，超声处理30 min，滤过，蒸干滤液，残渣加10 ml水并微热溶解，用正丁醇(水饱和)振摇萃取2次(每次30 ml)，合并正丁醇液，用氨试液洗涤正丁醇液3次(每次20 ml)，弃去氨液，蒸干正丁醇液，残渣加5 ml水使溶解；经大孔吸附树脂柱(12 cm×1.5 cm)，按步骤洗脱：50 ml水→30 ml 40%乙醇溶液→60 ml 70%乙醇溶液，收集70%乙醇溶液洗脱液并蒸干，残渣加2 ml甲醇溶解，作为供试品溶液[3，4]。另取适量的黄芪甲苷对照品，加甲醇溶解并定容，制备质量浓度为1 mg/ml的黄芪甲苷对照品溶液。另取黄芪对照药材细粉(过4号筛)3.0 g，按供试品溶液制备方法制成对照药材溶液。按处方工艺和比例制备缺黄芪的阴性样品，称取阴性样品3.5 g，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。按2015年版《中国药典》四部[2]TLC法试验，分别吸取以上4种溶液各10 μl，点到同一张硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-氯仿-甲酸-水(20∶10∶11∶5)的下层溶液(混合液于10 ℃以下放置时分层)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇液，在105 ℃加热至斑点显色清晰，置日光灯下检视。结果，在与对照品和对照药材薄层色谱的相应位置上，各供试品色谱显相同颜色的棕褐色斑点，阴性样品色谱无干扰。见图3。

1.阴性对照 2.对照品 3.对照药材 4～6.供试品

2.2含量测定

2.2.1色谱条件 色谱柱：Diamonsil C18(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-水(27∶73)；流速为1.0 ml/min；检测波长为270 nm；柱温为30 ℃；进样量为10 μl。

2.2.2溶液的制备

2.2.2.1对照品溶液的制备 精密称取适量的淫羊藿苷对照品，加甲醇溶解并定容，制成每1 ml含23.2 μg的溶液。

2.2.2.2供试品溶液的制备 精密称定经研细的本品内容物0.3 g，置于50 ml具塞锥形瓶中，精密加入20 ml甲醇，称定重量，超声处理30 min，自然冷却，再次称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，即得。

2.2.2.3阴性对照溶液的制备 按处方工艺和比例制备缺淫羊藿的阴性样品，精密称取阴性样品0.3 g，并按“2.2.2.2”项下方法制备淫羊藿阴性对照溶液。

2.2.3系统适用性试验 精密量取“2.2.2”项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各适量，按“2.2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图 4。由图4可知，在该色谱条件下进样分析，淫羊藿苷与其他成分可达到基线分离，分离度>1.5，理论塔板数不低于3 000。结果表明，其他成分对测定无干扰。

1.淫羊藿苷

2.2.4线性关系考查 精密吸取4、6、8、10、15和20 μl淫羊藿苷对照品溶液，按上述色谱条件进样分析。以进样量(X，μg)为横坐标、色谱峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得回归方程为Y=2 479X-2.553 1(r=0.999 9)。结果表明，淫羊藿苷进样量在0.093～0.464 μg之间具有良好的线性关系。

2.2.5精密度试验 取适量的淫羊藿苷对照品溶液，按上述色谱条件连续进样分析6次，记录色谱峰面积。结果，淫羊藿苷峰面积RSD为0.93%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.6稳定性试验 取适量的上述供试品溶液(批号120803)，在室温下放置0、4、8、10和12 h时，再按上述色谱条件进样分析，记录色谱峰面积。结果，淫羊藿苷峰面积RSD为1.47%(n=5)，表明供试品溶液在室温下放置12 h内基本稳定。

2.2.7重复性试验 精密称取适量的同一批号样品(批号120803)，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，共6份，再按上述色谱条件进样分析并计算含量。结果，淫羊藿苷的平均含量为1.403 1 mg/g，RSD为1.27%(n=6)，表明本方法重复性良好。

2.2.8加样回收率试验 取适量的已知含量样品(批号120803)，共9份，分别加入低、中、高质量的淫羊藿苷对照品，按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样分析，记录色谱峰面积并计算加样回收率，结果平均加样回收率为99.18%,RSD为1.20%。见表1。

表1 淫羊藿苷加样回收率试验结果(n=9)

2.2.9样品中淫羊藿苷含量测定 每批取3份，分别按“2.2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按上述色谱条件进样分析，记录色谱峰面积并计算样品中淫羊霍苷含量，结果见表2。

表2 样品含量测定结果(n=3)

3 结论与讨论

3.1定性鉴别 丹参、知母和黄芪为本方中主药，因而对这3味药进行定性鉴别，在制定鉴别方法时，从供试品溶液制备方法的选择、展开剂组成及比例的选择和拖尾控制等方面，参考了相关文献报道及《中国药典》方法，并进行了考查和优化，从而确定了最佳条件，方法简单可行。丹参薄层鉴别过程中，在处理方法选择时，分别考查了热回流和超声处理两种方法，最后选择采用超声处理的方法；在对丹参展开剂考查时，发现使用石油醚-乙酸乙酯-二氯甲烷为展开剂时阴性对照溶液有干扰斑点出现，故通过考查展开剂组成和比例，最终确定以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲苯-甲醇-甲酸(3∶4∶2∶0.5∶2)为展开剂进行展开，结果分离效果良好且斑点清晰[5，6]。知母薄层鉴别过程中，参照文献[7，8]制备供试品溶液和选择展开剂，对加入盐酸的用量和时间进行了考查，结果表明，在刚开始直接加入盐酸水解，发现滤液黏稠，不容易过滤，等提取液滤过后再加入盐酸效果更好；分别加入盐酸1、2和3 ml进行试验，结果表明2 ml的量就符合要求。黄芪薄层鉴别过程中，参照文献[3]制备供试品溶液，对大孔吸附树脂因素和氨水洗涤因素进行了考查，最终确定利用氨试液洗涤，采用D101型大孔吸附树脂柱，试验结果较满意。

3.2含量测定 本研究采用高效液相色谱法，参考了2015年版《中国药典》一部[9]和相关文献报道[10-12]，并进行了考查和优化，从而确定了最佳条件；提取溶剂考查时选择了50%乙醇、50%甲醇和甲醇，结果表明甲醇的提取效果最好；研究中还对超声提取时间进行了考查，分别超声提取20、30和40 min，结果表明提取30 min时样品中的淫羊藿苷已提取完全，且杂质较少。

综上所述，本方法简便、准确、灵敏度高，可用于糖肾康胶囊的质量控制。