基于根及根茎类药材显微特征的类叶牡丹显微鉴别及其2种总皂苷的HPLC-ELSD测定

刘 晴,李国玉*,吕鑫宇 ,朱丹丹, 张艳海,杜 倩,李 冉,吕春艳

[1.哈尔滨商业大学药学院，黑龙江省预防与治疗老年性疾病药物研究重点实验室，黑龙江 150076； 2.赛默飞世尔科技(中国)有限公司,上海 201203]

根及根茎类药材在中药材中占比较大，如《中国药典》2015版在上一版的基础上新收载了3个中药材品种，使收载中药材总数达到了529种，根及根茎类药材就占157种，并且增加了有些品种的显微鉴别项目，以加强药材的专属性鉴别。类叶牡丹为小檗科红毛七属植物的根及根茎，又名红毛七等，为东北地方药材，味辛、苦，具有理气止痛及祛风活血功效，民间广泛常用于风湿骨病、胃腹疼痛及妇科疾病等的治疗[1-3]。故本研究根据常见根及根茎类中药材的显微特征[4]，采用数码技术通过数码彩色图片显现类叶牡丹的显微特征，相较于传统的手描墨线图模式能够更加真实而直观。借此为例展现中药材的专属性，以期为根及根茎类药材的鉴别提供一定的参考。先前的研究[5]对类叶牡丹药材中的6种皂苷类成分进行了一测多评，未富集总皂苷部位，但三萜皂苷是类叶牡丹中的一类重要活性成分，富集总皂苷成其有效部位，是该药成药性研究的重要内容[6，7]，因此分别采用水饱和正丁醇萃取法、大孔树脂柱色谱法对该药的总皂苷进行富集，并以化合物leonticin D(1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷 (2)、Cauloside G(3)和Cauloside D(4)为对照品采用HPLC- ELSD法对多批次类叶牡丹总皂苷提取物进行了含量测定，对类叶牡丹总皂苷提取物为有效部位的成药性研究提供了研究依据。

1 仪器与试药

1.1仪器 Motic 数码显微镜 (中国，麦克奥迪公司，BA4000型)，镊子，载、盖玻片，刀片，酒精灯，扁药匙，牙签，滤纸。Waters 2695型高效液色谱仪(美国，沃特世公司)，Alltech 2000型ELSD检测器(美国，Alltech公司)。

1.2试药 水合氯醛及甘油(上海国药集团)；色谱纯甲醇及乙腈(美国Dikma公司)。AB-8大孔吸附树脂(天津南开化工厂)，732阳离子交换树脂(河北沧州河间水处理剂有限公司)；leonticin D(1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、 Cauloside G(3)、 Cauloside D(4)对照品均为自制(纯度98%以上)；人参、黄芪、甘草、大黄的粉末(过80～100目筛)，均由哈尔滨商业大学中药教研室购自哈药集团世一堂制药厂(批号分别为20170917,20180812,20180834,20180422)，类叶牡丹分别购自黑龙江、河北、安徽、湖北。上述药材经哈尔滨商业大学曲中原教授鉴定为人参(PanaxginsengC A Mey )、黄芪[Astragalusmembranaceus(Fisch)Bge]、甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、大黄(RheumpalmatumL)和类叶牡丹(CaulophyllumrobustumMaxim),样品标本保存于哈尔滨商业大学药学院。

2 方法与结果

2.1显微鉴别

2.1.1徒手切片法[8]在室温下，对类叶牡丹根及根茎分别进行徒手切片后观察分析。粉末显微采用水合氯醛透化法[9]，进行多次透化，直至达到透化观察要求。上述切片或透化粉末根据选取目标物的不同，切换Motic电子显微镜的目镜倍数，一般10×10 倍镜目标视野较好， 10×40倍镜以上有利于特征目标物的观察和测量，进而通过数码显微镜拍摄系统拍录目标物的显微鉴别特征。

2.1.2黄芪、甘草、黄连、大黄为例的粉末显微特征 黄芪、甘草、黄连、大黄均为药用部位为根或根茎或二者兼用的代表性中药，其粉末显微特征在鉴别根及根茎类中药时也具有代表性，比如黄连粉末显微特征中的鳞叶表皮细胞，石细胞、黄芪中的分叉纤维；甘草粉末显微特征中的晶鞘纤维；大黄中的草酸钙大簇晶、导管等。见图1。

2.1.3基于根及根茎类药材显微特征的类叶牡丹显微特征 类叶牡丹药用部位为根及根茎，其除具有一般根及根茎类药材的显微特征外，该药材因外在性状特征及生长环境，所以显微特征及后含物具有自身的特点。

a.黄芪的分叉纤维b.甘草晶鞘纤维 c.大黄草酸钙簇晶d.大黄螺纹导管 e.黄连鳞叶表皮细胞 f.黄连石细胞

2.1.3.1类叶牡丹根及根茎的横切面的显微特征 根及根茎呈圆柱形或类圆柱形，外表棕褐或棕黄色，部分表皮有木栓化，有时可见脱落的棕黄色栓皮，皮层较宽，韧皮部较窄，多为薄壁细胞组成，根中心木纤维集中，根及根茎中心有髓壁细胞，易形成髓。见图2。

1.木栓层 2.皮层 3.韧皮部 4.木质部 5.髓薄壁细胞

2.1.3.2类叶牡丹根及根茎粉末的显微特征 根及根茎均为黄白色粉末，表皮细胞多呈方形或类方形，根表皮细胞有的呈圆形，表皮木栓化细胞棕褐色，壁增厚，多呈方形，纤维导管多见，少见晶鞘纤维，石细胞方形或类圆形，少见丁字形石细胞。见图3。

1.表皮细胞 2.木栓细胞 3.纤维 4.晶鞘纤维 5.导管 6.石细胞

2.2含量测定

2.2.1溶液的制备

2.2.1.1对照品溶液的制备 先精确称取对照品leonticin D(1)、3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6)-β-D-吡喃葡萄糖苷(2)和Cauloside D(4)分别为3.19、3.49及3.20 mg，并置5 ml量瓶中,甲醇定容，摇匀, 过0.45 μm滤膜；再精确称量对照品Cauloside G (3)3.30 mg置10 ml量瓶中,依上法定容，过滤制成对照品溶液。

2.2.1.2供试品溶液的制备 称取类叶牡丹的根及根茎粗粉,分别用6 BV及4 BV 70%乙醇水回流提取,每次2 h,合并滤液,回收至干得类叶牡丹提取物。①类叶牡丹提取物蒸馏水溶解，用水饱和的正丁醇萃取3次,回收正丁醇,得正丁醇总皂苷部位；②类叶牡丹提取物水悬浮经AB-8大孔吸附树脂依次用蒸馏水、70%乙醇洗脱，70%乙醇洗脱组分经减压回收得大孔树脂总皂苷部位。取适量2种总皂苷样品，用甲醇稀释，过0.45 μm微孔滤膜，进样，使其峰面积在标准曲线范围内，供含量测定用。

2.2.2色谱条件及方法 色谱柱：Kromasil ODS (250 mm×4.6 mm,5 μm)；流动相为甲醇(A)-水(B)，梯度洗脱：0～10 min，60%～63% A；10～20 min，63% A；20～25 min，63%～100%A；25～30 min，100% A；体积流量：1.0 ml/min; 柱温30 ℃；ELSD检测器条件：漂移管温度90 ℃；气体流速 2.1 ml/min; 数据采集频率10 Hz；进样量10 μl。对照品及供试品液相色谱图见图4。

1.leonticin D2. 3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D -吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷 3. cauloside G 4. cauloside D

2.2.3线性关系考查 精密称量“2.2.1.1”项下的对照品1、2、4溶液，分别进样2、4、6、8和10 μl，取对照品3溶液，分进样别5、10、15、20和25 μl，按上述色谱条件，以对照品质量浓度的自然对数为横坐标(X)，以吸收峰面积的自然对数为纵坐标(Y)绘制标准曲线，计算回归方程及相关系数，并测定分析方法的检测限(LOD)。见表1。

表1 类叶牡丹皂苷对照品1～4的线性方程及相关数据

2.2.4精密度试验 分别取对照品溶液按“2.2.2”项下色谱条件重复进样6次，记录化合物leonticin D(1)、 3-O-β-D-吡喃葡萄糖-(1→3)-α-L- 吡喃阿拉伯糖-常春藤皂苷元-28-O-α-L-吡喃鼠李糖-(1 → 4)-β-D-吡喃葡萄糖-(1→6) -β-D-吡喃葡萄糖苷(2)、Cauloside G(3)和Cauloside D(4)峰面积，计算峰面积的RSD分别为0.74%、0.86%、0.98%和1.02%，均小于2%, 符合要求。

2.2.5稳定性试验 取供试品溶液在室温下，分别于0、3、6、9和12 h按“2.2.2”项下色谱条件分别进样5次，记录化合物1、2、3和4的峰面积，其峰面积的RSD分别为1.48%、1.94%、0.33%和1.34%，均小于2%, 符合要求。

2.2.6重复性试验 精密称量供试品溶液共6份，按“2.2.2”项下色谱条件分别进样，记录化合物1、2、3和4的峰面积，其峰面积的RSD分别为1.41%、0.89%、2.65%和1.83%，均小于3%, 符合要求。

2.2.7加样回收率试验 精密称取已知含量的类叶牡丹供试品粉末6份，按照供试品所含对照品1∶1比例加入相应对照品，并制备成供试品溶液，测定化合物1、2、3和4的含量，结果化合物1、2、3和4的平均回收率分别为99.63%、98.52%、99.41%和98.15%，RSD分别为1.80%、1.47%、1.40%和1.02%，表明准确性良好，方法可行。 见表2。

2.2.8样品含量测定 精密称定“2.2.1.2”项下制得类叶牡丹正丁醇浸膏粉末84.5 mg, 定至25 ml量瓶中，充分溶解，经0.45 μm微孔滤膜过滤，进样10 μl，平行进样3次，记录与对照峰保留时间一致峰的面积，通过标准曲线计算含量。不同产地类叶牡丹正丁醇部位及AB-8大孔吸附树脂部位总皂苷中各化合物百分含量结果见表3。

表2 类叶牡丹4种皂苷的回收率测定结果(n=9)

表3 样品百分含量测定结果

3 讨论

3.1根及根茎类药材，特别是根茎部分，大多纤维性较强，因其本质为茎，所以横切面显微观察到髓，类叶牡丹根的显微特征因其颜色特征，在显微特征中可观察到棕褐色的木栓细胞。植物的细胞后含物是其对生长环境的应激，比如在粉末中观察到的晶纤维及丁字形石细胞猜测与植物对环境的应激有关，与以往的报道相比，首次在该植物中观察到晶纤维。

3.2在精制富集总皂苷时，本文选用的两种方法都是常用的经典方法，但由于类叶牡丹中含有大量的五环三萜双糖链皂苷[10]，因此极性较大，特别是在AB-8大孔吸附树脂为弱极性树脂，因此在柱色谱洗脱时，在水洗脱时注意控制水的用量，以免大极性皂苷随水洗脱出来。

3.3 关于对照品的选择，在研究中发现类叶牡丹中的五环三萜双糖链皂苷极性相近，有很多同分异构体，原有色谱条件下分离度不够理想，因此在已有研究的基础上，通过调整色谱条件中的流动相实现了良好的分离，另外这4种对照化合物含量较高，其三萜皂苷母核葳严仙皂苷元和常春藤皂苷元是类叶牡丹中三萜皂苷的两种主要代表性皂苷元也是选择的另一原因。