FXR在肝脏疾病中的作用及其激动剂的研究进展

隋常琪，马宇衡，赵 岩，牧 童，赵思宁，杨 慧

(内蒙古医科大学药学院, 内蒙古 010110)

法尼醇X受体最初因可被超生理浓度的法尼醇激活而得名，随后发现生理水平的胆汁酸和其代谢产物即可激活受体，又名胆汁酸受体。FXR最为重要的生理功能是对胆汁酸(BA)的负反馈作用，BA现在被认为是调节复杂的肠肝和全身代谢功能的相关信号分子。当配体和配体结合域结合之后，FXR空间结构发生变化，招募共激活因子和视黄醛衍生物受体(RXR)以单体或二聚体形式结合于靶基因启动子区的FXR反应元件(FXRE)来调控下游靶基因的转录(图1)。FXR可以抑制炎症细胞浸润、促进肝肠循环及肝细胞再生[1，2]、延缓肝纤维化/肝硬化进程。研究表明，FXR敲除小鼠自发肝癌的过程与人类患肝细胞癌的过程基本相同，也经历了肝炎、肝纤维化、肝硬化等阶段最后发展至肝癌[3]。可见法尼醇X受体对肝脏起重要保护作用，或许可作为药物靶点参与肝脏疾病演变的各个环节的治疗。现就FXR对肝脏保护调节的作用机制及FXR激动剂的研究做一综述。

FXR.法尼醇X受体 RXR.视黄醇X受体

1 FXR与胆汁淤积

胆汁淤积是指胆汁的分泌与排泄发生异常，影响正常的肝肠循环使胆汁酸淤积于肝内。胆汁淤积或许是肝癌发生的一大环节，肝癌细胞中FXR的表达程度与血清总胆汁酸浓度高低有一定关系，FXR-胆汁酸通路在胆汁酸平衡中发挥重要作用。FXR的下游靶基因小分子异源二聚体(small heterodimer partner, SHP)被FXR激活后表达上调，通过FXR-SHP-LRH-1级联反应抑制胆汁酸合成限速酶CYP7A1的表达，缩减胆汁酸池[4]。FXR激动剂对SHP-/-小鼠的CYP7A1表达没有任何影响[5]，证明FXR通过依赖SHP途径负反馈调节CYP7A1的表达。然而，FXR-SHP-CYP7A1通路并不是调节CYP7A1表达的唯一途径，非依赖SHP途径中FXR作用于小肠使成纤维细胞生长因子15/19 (FGF15/19)的分泌增加，与肝细胞表面受体FGFR4结合，激活JNK依赖的信号途径抑制CYP7A1的表达[6]。肝星状细胞分泌的FGF7则特异性结合FGFR2通过JNK途径抑制CYP7A1的表达，降低胆汁酸的合成水平，两种调节胆汁酸水平的途径在肝脏再生的不同阶段均占重要地位[7]。最近的研究发现[8]，长期喂食FGF21的小鼠肝脏和小肠中的胆汁酸水平下降了50%～60%，胆汁酸池的大小减少了60%。而在胆囊切除模型中，FGF21的过表达间接拮抗FGF15/19通过βklotho/FGFR 4的功能增加了胆汁酸的合成和胆汁酸库的大小[9]。另一方面，FGF21被FXR激活后通过改善脂肪酸的氧化和脂解脂肪细胞调节动物的脂代谢，并增加胰岛素敏感性，减轻肝脏脂肪负担[10]。FXR上调SHP，促进SREBP-1c的表达，抑制脂肪酸和甘油三酯的合成与分泌[11]；激活PPARα加速脂肪酸β氧化，使游离脂肪酸减少[12]；FXR从胆汁酸水平和脂质代谢两方面协同作用减少肝脏负担。除此之外，FXR激动剂所引起的瘦素和脂联素的分泌进一步增加了抗脂肪肝和肝纤维化的作用。虽然喂食 (蛋氨酸和胆碱缺乏饮食)MCD的FXR小鼠血清中ALT、AST和胆汁酸水平明显升高，但相对于Wt/MCD小鼠来说，FXR-/-/MCD小鼠脂肪变性程度更低，肝脏甘油三酯(TG)水平也降低[13]，肝脏甘油三酯含量似乎受到胆汁酸-fxr-shp轴的调节，原因可能是胆汁酸水平的增加抑制了肝甘油三酯的积累，这与Kunne等[14]的研究相一致。可见FXR调节胆汁酸平衡在肝脏疾病中的作用是十分重要的。高浓度的胆汁酸会产生细胞毒性、氧化应激和凋亡，导致肝实质的损伤，FXR激活后上调运载体胆汁酸运输蛋白BSEP,多元抗药性基因MDR和多药抗药性相关蛋白MRP2的表达，促进胆汁排出[15]。FXR分别增加CYP3A4，SULT2A1和UGT2B4的表达使胆汁酸羟基化、硫酸化、葡萄苷酸化以增加BA亲水性并降解BA的毒性作用[16]。FXR在胆汁酸的合成，转运和代谢的各个过程均有参与，FXR-胆汁酸通路的研究为胆汁淤积引起的肝脏疾病的治疗提供了多个靶点(图2)。

图2 FXR能从胆汁酸代谢

2 FXR与肝炎

肝脏的急、慢性炎症多由HBV、HCV感染引起的，HCV感染引起肝癌的概率是HBV感染的3倍。当感染性肝炎进展为肝硬化时，患肝癌的概率会显著增加[17]。炎症是免疫系统对损伤因子的防御性反应，FXR及其相应的配体被认为是细胞炎症和免疫反应的调节因子，FXR是依赖NF-κB通路发挥抗炎作用的[18]，在幼鼠出生后7个月内阻断NF-κB信号通路，肝脏炎症就不会发生。正常情况下，NF-κB与抑制蛋白结合以三聚体的形式存在，不发挥作用，当肌体受到刺激时，抑制蛋白被降解暴露出结合位点与游离的NF-κB二聚体结合，发挥转录调节作用。FXR抑制NF-κB信号的转导，减少炎症因子(TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6)的表达达到抗炎效果。伴刀豆球蛋白A(concanavMin A，Con A)诱导的自身免疫性肝炎小鼠体内炎症因子(IFN-γ、TNF-α、IL-4和IL-2)分泌增加，鹅去氧胆酸CDCA激活ConA诱导CIH小鼠中的FXR时，保护因子促甲状腺素胚胎因子TEF表达上调，炎症因子明显下降，FXR通过与TEF的相互作用减少炎症因子的分泌发挥保肝作用[19]。fxrko-pcls(精确切割肝脏切片)中，FXR缺乏可加重环孢菌素A (CSA)的肝毒性作用，线粒体功能和炎症的主调节因子PPARδ和其靶基因被CDCA以FXR依赖的方式显著上调，减少CSA所致的氧化应激和线粒体功能损害[20]。有研究发现，炎性因子IFNγ会促使炎症诱导肿瘤的发生，虽然10月龄的FXR-/-小鼠有14.3%的肿瘤发生率，但同龄的IFNγ-/-FXR-/-小鼠患肿瘤的概率可达到82.8%，所以推测IFN-γ在肝脏疾病中或许具有一定保护作用[21]。CCl4所致肝损伤模型中， NF-κB、Raf MEK、 PI3k Akt、MAPK ERK/P38 等多个与炎症相关的信号通路被激活[22]。因此，到目前为止法尼酯X受体的抗炎机制仍不十分明确。FXR在肝炎的调节与治疗上占据重要地位，为防止炎症进展为恶性肿瘤提供了新的策略。

3 FXR与肝纤维化

世界范围内患有肝纤维化(liver fibrosis, LF)疾病的人数超过1千万人,未来15年内LF患者将增至3倍。肝内胆汁淤积、脂质堆积、炎症等损伤因素持续作用于肝脏时，促使肝脏释放大量的炎症因子，炎症因子激活肝星状细胞(HSC)，提高其增殖能力并使细胞外基质(ECM)分泌增加，因降解失衡导致肝纤维化。FXR完全激动剂GW4064可以减少胆汁淤积小鼠模型中肝脏纤维化的程度。FXR在HSC中的表达很少，所以Verbeke认为FXR激动剂减慢肝脏纤维化进程是通过抑制NF-κB活性，减少炎症因子对HSC的刺激达到的[23]。除此之外，FXR配体通过提高PPAR-γ的表达，降低α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)水平，使活化HSC转向静息态HSC，减少HSC表达Ⅰ型胶原和促纤维化介质TGF-β1的能力[24]。肝纤维化后期大量胶原着床， TGF-β1水平明显提高，导致肝损伤加重，GW4064上调FXR的表达激活SHP，减少胆汁酸和脂肪对肝细胞的毒性作用，同时抑制FXR配体引起的Ⅰ型胶原mRNA的表达。SHP的上调使AP-1与Ⅰ型胶原DNA结合力降低，从而减少ECM沉积[25]。胆管结扎BDL实验结果表明，6-ECDCA能有效地缓解肝纤维化，消除BDL引起的Ⅰ型胶原、TGF-β1、TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表达增加[26]。TIMP-1和TIMP-2 mRNA的减少会增加的MMP活性，进而减少细胞外基质的沉积，因为MMP 是一种降解 ECM 的金属酶, TIMP通过激活 MMP 的活性来增加 ECM 的降解。FXR-/-小鼠体内的RECK mRNA含量明显低于Wild-type型小鼠，FXR激动剂亦可通过FXR-RECK-MMP级联反应减少ECM沉积[27]。这些研究表明，抑制ECM的过度增殖或减少炎症因子的刺激有助于FXR的抗纤维化和促分解活性。

4 FXR与肝硬化

如果不能得到有效治疗的话，慢性肝病患者最终会发展为肝细胞癌(HCC)，丙型肝炎相关的肝硬化患者，十年内HCC发病率达1/3[28]。肝硬化后期肝功能损害加重并伴随门脉高压(PHT)的产生。PHT的病理基础是肝内血管阻力增加，这是由结构重塑(纤维化和疤痕)和功能改变(收缩性肝星状细胞和内皮功能障碍)引起的。内皮功能障碍主要是由于肝窦内皮细胞一氧化氮(NO)信号受损和血管收缩素(内皮素-1)活性增加所致，FXR除了在胆汁酸代谢和抑制炎症因子方面起作用外，也参与血管功能的调节。FXR通过上调内皮型一氧化氮合酶(eNOS)，降低诱生型一氧化氮合酶(iNOS)和COX-2的表达影响血管NO信号，FXR激动剂px 20606增强二甲基精氨酸二甲氨基水解酶1(Ddah1)的表达，诱导eNOS的表达促进NO生成[29]。因为eNOS催化生成NO需要足够浓度的Bh4，所以同时促进四氢生物蝶呤(Bh4)合成的关键酶GCH-1的生成[30]。这种同时增加eNOS活性和产生Bh4的协同作用共同改善了NO参与的肝窦内皮功能，介导血管扩张，最终使门静脉压力降低。FXR激动剂还通过抑制内皮素-1(ET-1)介导的肝星状细胞收缩，增加肝胱硫醚酶(Cth)介导的H2S的产生，进一步缓解肝内阻力。血管生成在肝窦和组织重建中起着至关重要的作用，肝硬化中动物血管生成素 (Ang1、Ang2)，血管生成的典型介质血管内皮生长因子(VEGF)和血小板源性生长因子(PDGF)显著降低[31]，病理性血管生成减少与纤维化程度降低有关。CCl4大鼠经FXR激动剂治疗后，病理性肝血管生成信号表达趋于正常化，血清转氨酶水平降低和肝巨噬细胞浸润的趋势减慢。奥贝胆酸(OCA)通过改善肠道屏障功能和减少大鼠肠道细菌易位引起的内脏炎症恢复内皮功能，降低部分肝硬化动物的门静脉压力[32]。

5 FXR与肝细胞癌

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是常见的恶性实体肿瘤，其特点是大量的血管生成，肿瘤细胞通过渗入新生血管的组织裂隙进入血液循环完成侵袭和转移。HCC过度增殖是肌体内各种因素共同作用的结果，但微血管的生成和细胞周期紊乱，是细胞增殖失控的重要原因。FXR是重要的抑癌基因，研究表明，CD31在肝癌组织中大量表达，而经GW4064 处理的肿瘤组织中新生血管少，且几乎无CD31表达，表明激活 FXR的表达可抑制HCC新血管的生成。FXR激动剂处理的裸鼠肿瘤组织中细胞增殖核抗原(Ki67)的表达明显降低，提示FXR的激活可显著抑制肝癌细胞移植瘤的增殖[33]。细胞增殖同时受到信号通路、癌基因等多方面的调控，信号转导子和转录激活子3(STAT3)是JAK和STAT信号通路中的重要因子，介导多种信号转导，抑癌基因P53与其下游靶基因P21在FXR-/-小鼠肿瘤组织内表达明显低于Wild-type小鼠，是细胞周期G1的代表性检查物，FXR可通过上调细胞信号转导抑制蛋白3(SOCS3)的表达抑制JAK2-STAT3通路的转导，激活细胞周期关键分子P21的表达，诱导细胞阻滞于G1期[34]。FXR缺失后高浓度胆汁酸激活wnt/β-catenin信号通路，使炎症因子大量增加，同时激活癌基因 c-myc，促进肝细胞增殖，诱导肿瘤形成[35]。FXR通过抑制p16/Ink4a的表达刺激细胞增殖，相反，ras/ERK通路的激活则降低FXR的表达，从而抑制肝癌细胞的增殖[36]。最新的研究发现，FXR可与非编码小分子RNA micro RNA-122(miR-122)的3′-非翻译区上的FXRE结合，抑制整合素金属蛋白酶10(ADAM10)和胰岛素样生长因子1受体(IGF-1R)在HCC的表达，减慢肝脏细胞的增殖分化，减缓癌细胞迁移和侵袭进程[37]。相反的，miR-421可直接靶向FXR,降低其表达进而促进肿瘤的增殖[38]。FXR与其靶基因的相互作用机制并不清晰，所以FXR-miRNAs通路或许会成为抗HCC的新靶点。

6 FXR激动剂的研究

现如今，研究人员致力于开发FXR配体，但只有少数化合物达到临床发展的早期阶段。甾体类激动剂奥贝胆酸(Ocaliva,OCA)，又称INT-747或6-ECDCA，是活性最强的FXR激动剂鹅脱氧胆酸(CDCA)的6位乙基化产物，于2016年被FDA批准治疗原发性胆汁性肝硬化 (primary biliary cholangitis，PBC)，活性强于CDCA 100倍[39 ]。单药疗法已进入Ⅱ期临床研究，其与熊去氧胆酸(UDCA)联合治疗PBC已进入Ⅲ期临床研究，但缺点是瘙痒症随剂量增大而加重且伴随HDL降低和LDL升高的副反应。甾体类激动剂因较差的核受体选择性已无研发空间，所以科研人员将重点转向非甾体类激动剂的研究。GW4064是2000年发现的高亲和性非甾体类FXR激动剂，属于3，5-二取代异噁唑类，但由于生物利用度不高，分子结构中的二苯乙烯结构潜在毒性大，且发现有脱靶效应而终止了临床[40]。将二苯乙烯结构用喹啉环取代合成了FXR激动剂GSK2324，既避免了二苯乙烯的潜在毒性，又提高了水溶性，但因易产生副反应不得不进一步对其结构改造[41]。LJN 452相比于GW4064来说显著地提高了ADME，低剂量下高选择性地作用于FXR靶基因，志愿者的耐受性较好，并已进临床试验的第二阶段[42]。WAY-362450(FXR-450/XL 335)是高选择性的口服FXR激动剂(EC50=4 nm)，一种新型的吖庚因并[4，5-b]吲哚类似物，可有效地降低多种血脂异常模型的血清TG水平和VLDLc，其对小鼠的疗效与临床用药非诺贝特的疗效相当[43]，在肝脏甘油三酯积聚继发的肝脏炎症中有保护作用，目前治疗高脂血症的Ⅰ期临床试验阶段已经完成。与其有同样适应症的哌啶-异噁唑类的高选择性FXR激动剂ly2562175现已处于临床Ⅰ期试验评价中，有很好的调脂作用，降低LDL和TG的同时提高临床前物种的HDL水平[44]。此类激动剂大部分是从优化GW4064结构得到的，结构具有多样性。但由于毒理学或药物动力学问题，几类FXR激动剂的开发已经停止。在对GW4064的改造过程中发现部分化合物由激动剂型转向拮抗剂型，与激动剂不同的是，FXR拮抗剂在降低LDL和TA的同时升高HDL的水平，这使得FXR拮抗剂成为治疗血脂异常新的靶标。已上市的大部分非甾体类抗炎药(NSAIDs)如吲哚美辛、布洛芬、保泰松等都有拮抗FXR的活性，但NSAIDs易致肝损伤的不良反应是众所周知的，FXR在炎症方面的调节作用可以解释这一负反应发生的原因，因为NSAIDs通过抑制FXR的活性诱导肝损伤的机制已经得到证实[ 45]。综上所述，FXR的绝对激动或抑制都会给肌体造成不同程度的损伤，或许只有选择性地作用于受体才能得到期望的治疗效果。

7 结语与展望

HCC的预后差使肝癌患者死亡人数的有逐年上升趋势。目前尚未有有效的治疗手段，而肝移植是发展为肝病晚期患者的唯一有效的治疗方法[46]，但受价格和肝源的限制，手术切除成为人们的第一选择，但手术时能否根治性切除，剩余肝脏体积等也影响着患者的生存与预后[47]。因此，早期的诊断与预防是患者提高存活率和生活质量的关键。

治疗肝脏疾病的黄金时间是疾病处于NAFLD阶段，此阶段的主要特点是肝细胞脂肪变性和脂质沉积，NAFLD进展为肝细胞癌的发病机制复杂，目前人们比较接受的是“两击” 假说。第一次打击是肝脏中脂质沉积导致的肝脏脂肪变性，过多的甘油三酯是肝纤维化的标志[48]，第二次打击是脂质过氧化、线粒体功能障碍导致肝脏损伤，并通过中性粒细胞浸润促进炎症反应[49]。在此阶段进行干预治疗是预防肝脏疾病发展为HCC最有效的手段。FXR通过级联反应信号通路、G蛋白耦联受体、细胞表面受体、抗原受体等介导的多条信号通路形成复杂的调控网络保护肝脏免受致病因子的损伤。随着对FXR及其功能的深入了解，针对不同靶点进行结构改造的FXR激动剂逐渐问世，期望能找出合适的治疗靶点将癌变扼杀在NAFLD阶段，设计高效低毒的FXR激动剂需要所有研究人员的共同努力，未来FXR激动剂在肝脏疾病的治疗中也许会占据一席之地。