阿帕替尼对肺腺癌H1650细胞增殖、活性氧水平和凋亡的影响

宋永安，刘海洋，张晓菊

郑州大学人民医院呼吸内科 郑州 450003

在全球范围内，肺癌是发病率较高的癌症之一，患者的5 a生存率低于15%[1-3]。虽然目前治疗方法非常丰富，但是肺癌患者的治疗效果和预后依然令人担忧[4-5]。阿帕替尼是我国自主研发的一种抗血管新生靶向药物，能阻断血管内皮生长因子与其受体结合后的信号转导，从而强烈抑制肿瘤血管生成并发挥抗肿瘤作用[6]。临床试验[7]证实，阿帕替尼用于标准化疗失败的晚期胃癌患者时，可以观察到明确的治疗效果和显著的生存获益。目前，迫切需要寻找新的药物以抑制肺癌细胞的增殖，从而改善肺癌患者的疗效[8]。H1650是最常见的肺腺癌细胞系，作者观察了阿帕替尼对肺腺癌H1650细胞体外活性的影响，为临床治疗肺癌提供理论依据，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1细胞和主要试剂H1650细胞购自中国科学院细胞库；阿帕替尼购自中国美伦生物有限公司；RPMI 1640培养基、胎牛血清购自以色列BI公司；CCK-8试剂购自日本同仁有限公司；活性氧(ROS)和Annexin V-FITC检测试剂盒购自中国上海碧云天生物技术有限公司；Cleaved Caspase-3抗体购自中国恩晶生物公司。

1.2细胞培养用RPMI 1640完全培养基在60 mm培养皿中培养H1650细胞，完全培养基中含体积分数10%胎牛血清。将H1650细胞置于含有体积分数5% CO2、饱和湿度的37 ℃培养箱中常规培养。细胞长至大约80%融合时传代1次，每2 d更换1次培养基。取处于对数生长期的细胞进行实验。

1.3不同浓度阿帕替尼对H1650细胞增殖的影响用胰蛋白酶消化处于对数生长期的H1650细胞，用适当比例的培养基稀释，然后进行计数，每孔3 000个细胞均匀接种于96孔板中。24 h后弃去原有培养基，加入含阿帕替尼[0.000(阴性对照)、0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000、8.000、16.000、32.000、64.000 μmol/L]的培养基。72 h后每孔加入10 μL CCK-8孵育4 h。用酶标仪于450 nm波长处测定吸光度值，计算细胞增殖抑制率，细胞增殖抑制率=(1-阿帕替尼组吸光度值/阴性对照吸光度值)×100%；计算阿帕替尼对H1650细胞的IC50。实验重复3次。

1.4不同浓度阿帕替尼对H1650细胞克隆形成能力的影响将H1650细胞接种在6孔板中，每孔1 000个细胞，24 h后弃去培养基，然后加入不同浓度(0、2、4、8 μmol/L)的阿帕替尼孵育9 d后，用PBS冲洗细胞。将细胞在多聚甲醛中固定20 min，再次清洗细胞。用结晶紫染色30 min，清洗后在室温下风干，用相机拍照并用Image J软件分析克隆形成率，克隆形成率=给药组细胞数/对照组细胞数×100%。实验重复3次。

1.5不同浓度阿帕替尼对H1650细胞内ROS水平的影响将H1650细胞以每孔2×105个接种于6孔板中，过夜后每孔分别加入含0、8、16、32 μmol/L 阿帕替尼的培养基。24 h后用胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS洗涤2次后，用无血清培养液稀释DCFH-DA 1 000倍，孵育细胞20 min。为了防止细胞表面残损的DCFH-DA干扰实验结果，细胞需要用无血清培养基洗涤3次。用流式细胞仪检测高荧光强度细胞所占比例，即代表细胞内的ROS水平。实验重复3次。

1.6不同浓度阿帕替尼对H1650细胞凋亡的影响将H1650细胞接种在6孔板(2×105个/孔)中孵育24 h，然后用不同浓度(0、8、16、32 μmol/L)的阿帕替尼培养48 h。收获细胞并用冷PBS洗涤2次，然后重悬于含有5 μL Annexin V-FITC染色液的500 μL结合缓冲液中。将细胞在黑暗中温育20 min，然后将5 μL PI染色液加入细胞悬液中。30 min内用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。实验重复3次。

1.7不同浓度阿帕替尼对H1650细胞CleavedCaspase-3蛋白表达的影响采用Western blot法。将H1650细胞接种于培养皿中，加不同浓度(0、8、16、32 μmol/L)的阿帕替尼培养48 h，胰蛋白酶消化、收集细胞，PBS清洗2次，用含有蛋白酶抑制剂混合物的RIPA缓冲液在冰上裂解细胞，4 ℃ 11 000×g离心20 min，取上清用BCA试剂盒测蛋白浓度，然后取上清与6×Loading Buffer按体积比5∶1混匀，100 ℃水浴锅煮蛋白10 min。取等量蛋白样品在SDS-PAGE中电泳，然后将其转移到NC膜上，取出NC膜于50 g/L脱脂牛奶中室温封闭2 h，加入一抗孵育，4 ℃过夜，次日用TBST洗膜3次，每次10 min。加辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2 h，TBST洗膜，每次10 min，共3次，利用化学发光法检测蛋白表达水平。采用GAPDH作为内参，用Image J软件分析目的蛋白相对表达量。实验重复3次。

1.8统计学处理采用SPSS 19.0进行数据分析。不同组间细胞增殖抑制率、克隆形成率、ROS水平、细胞凋亡率及Cleaved Caspase-3蛋白相对表达量的比较均采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1阿帕替尼对H1650细胞增殖的影响细胞增殖抑制率测定结果见表1。阿帕替尼对H1650细胞的IC50为18.37 μmol/L。

表1各组H1650细胞增殖抑制率的比较

%

F=1 976.258，P<0.001；*:两两比较，P均<0.05

2.2阿帕替尼对H1650细胞克隆形成能力的影响结果见图1。可以看出，阿帕替尼可减弱H1650细胞的克隆形成能力。0、2、4、8 μmol/L阿帕替尼组H1650细胞克隆形成率分别为(100.00±3.67)%、(46.67±2.80)%、(37.47±2.37)%、(8.39±2.23)%，4组间比较，差异有统计学意义(F=366.455，P<0.001)；且组间两两比较，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

2.3阿帕替尼对H1650细胞内ROS水平、凋亡率、CleavedCaspase-3蛋白表达的影响结果见图2、表2。可知，阿帕替尼可提高细胞内ROS水平，促进细胞凋亡和Cleaved Caspase-3蛋白的表达。

A：0 μmol/L阿帕替尼组；B：2 μmol/L阿帕替尼组；C：4 μmol/L阿帕替尼组；D：8 μmol/L阿帕替尼组

1：0 μmol/L阿帕替尼组；2：8 μmol/L阿帕替尼组；3：16 μmol/L阿帕替尼组；4：32 μmol/L阿帕替尼组

图2 各组H1650细胞中 Cleaved Caspase-3蛋白表达的检测结果

*:两两比较，P均<0.05；#：与0 μmol/L阿帕替尼组比较，P<0.05

3 讨论

目前，我国肺癌的发病率越来越高，我国肺癌的病死率在所有癌症中处于第1位[9]。化疗是常用的治疗肺癌的方法，但是化疗药物因为不良反应而在临床应用中受到限制，迫切需要寻找新的治疗药物[10]。阿帕替尼是我国自主研发的抗血管新生靶向药，具有较少的不良反应。该研究发现阿帕替尼能够直接抑制肺腺癌H1650细胞增殖，有望为临床治疗肺癌提供新思路。

ROS生成增多与细胞死亡密切相关。ROS能直接作用于细胞膜，氧化磷脂双分子层，损害细胞膜的功能，同时细胞膜损伤后又能产生自由基，造成级联反应，过度产生的自由基还能使细胞内的蛋白质、脂质、DNA等发生交联，引发细胞死亡[11]。ROS还能损伤细胞核中的DNA，使细胞有丝分裂发生紊乱，最终导致细胞凋亡[12]。至今，已经鉴定出大量的ROS产生剂，如丙卡巴肼，依靠ROS产生发挥其抗癌功效[13]。本实验证实，阿帕替尼可以增加H1650细胞内ROS水平。ROS在细胞凋亡中发挥着重要作用。Caspase是与细胞凋亡相关的蛋白酶家族，它们存在于细胞质中，其激活后可以促进细胞凋亡的发生。人类Caspase成员较多,已经发现有11个成员,其中Caspase-3是最重要的成员之一[14]。

有文献[15]报道，阿帕替尼对人肝癌HepG2细胞的IC50为8.4 μmol/L。研究[16]发现，阿帕替尼能抑制人结肠癌HCT-116细胞增殖，促进HCT-116细胞凋亡，并且能激活Caspase家族通路。本研究结果显示，阿帕替尼可抑制肺癌H1650细胞增殖，其IC50为18.37 μmol/L。在低于IC50时，阿帕替尼(2、4、8 μmol/L)就能阻碍H1650细胞集落形成。在IC50附近时，阿帕替尼还可以通过提高H1650细胞内ROS水平，促进细胞内氧化反应的发生。作者还发现阿帕替尼作用于H1650细胞后，早期和晚期细胞凋亡率明显增加，Cleaved Caspase-3表达水平升高，提示其能够通过促Cleaved Caspase-3的表达进一步激活Caspase凋亡相关通路，最终使肺癌H1650细胞走向凋亡。

综上所述，阿帕替尼可促进H1650细胞内ROS的生成，进而诱发H1650细胞凋亡，使其增殖受到抑制，有望成为治疗肺癌的新药物。