食管鳞癌组织中E-cadherin蛋白表达及对术后预后的影响

韩少华，万里新，李秀敏，王海玲，董金城，靳 艳，)，杨 洋,)，肖凡凱，宋 昕 ，

胡守佳1)，赵学科1)，王建坡7)，王立东1)

1) 郑州大学第一附属医院河南省食管癌重点开放实验室；省部共建食管癌防治国家重点实验室 郑州 450052 2) 南阳市中心医院肿瘤科 河南南阳 473003 3) 新乡医学院第三附属医院胃肠科 河南新乡453003 4) 淇县人民医院内科 河南淇县 456750 5) 新乡医学院基础医学院组织学与胚胎学教研室 河南新乡453003 6) 郑州大学基础医学院病理学与病理生理学教研室 郑州450001 7)安阳市肿瘤医院肿瘤防治办公室 河南安阳455000

食管癌是世界上最常见的九大恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率居高不下，发现晚和复发转移一直是食管癌研究的重大难题[1-2]。中国作为食管癌高发国家之一，其病理类型主要为鳞癌。E-cadherin是钙黏附蛋白家族的成员之一，是一种细胞骨架黏蛋白，在正常上皮组织中发挥调控细胞分化，维持细胞结构完整性和极性等重要作用。近年来的研究[3-4]表明，E-cadherin的表达减少或丢失与肿瘤临床病理表现有一定关系，然而，E-cadherin蛋白表达对食管癌预后的影响仍存在争议。本研究利用50万例食管癌和贲门癌临床信息数据库的资料，在大样本的基础上分析E-cadherin蛋白表达与食管鳞癌患者术后预后的关系，报道如下。

1 对象与方法

1.1研究对象从河南省食管癌重点开放实验室50万例食管癌和贲门癌临床信息数据库中选取1985年至2016年入库的研究对象。纳入标准：确诊为食管鳞癌且经手术治疗，术前均未接受过针对肿瘤的治疗(化疗、放疗等)，临床病理信息完整且组织标本经HE染色、显微镜观察确认细胞结构完整、无坏死。排除脱片造成的不能判断免疫组化染色结果者。入组患者5 620例，男3 652例，确诊年龄(60.4±8.4)岁，女1 968例，确诊年龄(61.5±8.0)岁；参考UICC/AJCC制定的第6版食管癌TNM分期标准，Ⅰ期221例,Ⅱ期2 828例,Ⅲ期2 343例,Ⅳ期228例；浸润程度：黏膜层185例，肌层1 324例，纤维膜3 998例，纤维膜外113例；淋巴结转移阳性2 568例，阴性3 052例；组织分化程度：高分化485例，中分化3 209例，低分化1 926例。

1.2食管鳞癌组织中E-cadherin蛋白的检测将入选患者蜡块标本中癌组织集中区域进行标记并设计7×16微列阵，以0.15 mm直径打孔，重新制成组织芯片模型并固定，然后进行免疫组化染色。兔抗E-cadherin抗体(GB13083-1，1∶500)、PBS(pH 7.4)、柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)、免疫组化染色试剂盒(G1210-2)均为武汉Servicebio技术开发有限公司产品。按照试剂标准流程进行实验。石蜡切片经二甲苯、无水乙醇梯度脱蜡至水，柠檬酸抗原修复，体积分数3%双氧水避光孵育以阻断内源性过氧化物酶，BSA血清封闭，加兔抗E-cadherin抗体4 ℃孵育过夜，加二抗(G1210-2,即用型)，DAB显色，苏木精复染，常规脱水、透明、封片。以已知的阳性切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照，400倍光镜下观察。E-cadherin蛋白免疫阳性细胞表现为细胞膜棕黄色颗粒状均质着色，细胞质几乎不着色。结果判定采用本实验室已建立的ABC法[5-6]。根据阳性细胞染色程度判定：无染色为0分；胞膜有淡黄色颗粒，明显高于背景者为1分；有较多棕黄色颗粒者为2分；有大量深棕黄色颗粒者为3分。每张切片于400倍镜下计数全部阳性细胞数和细胞总数，计算阳性细胞百分比，<5%为0分，5%～为1分，25%～为2分，≥75%为3分。两项评分相加，0～1分为阴性，2～3分为弱阳性，4分以上为强阳性。

1.3随访确诊后开始跟踪随访，记录患者死亡时间及死亡原因，随访截止时间为2018年6月8日，终点事件为死亡。随访方式有电话随访、走访入户调查、村医及村干部问询、肿瘤登记册查询等。

1.4统计学处理采用SPSS 21.0进行分析。不同临床特征患者癌组织中E-cadherin蛋白表达的比较采用秩和检验。采用Kaplan-Meier法绘制不同临床病理特征患者的生存曲线并进行log-rank检验；采用Cox回归模型筛选食管鳞癌术后预后的独立影响因素。检验水准α=0.05。

2 结果

2.1食管鳞癌组织中E-cadherin蛋白的表达免疫组化染色结果见图1。不同临床病理特征食管鳞癌患者癌组织中E-cadherin蛋白表达的比较见表1、2。

A:阴性；B弱阳性；C：强阳性

临床病理特征 nE-cadherin表达阴性弱阳性强阳性Z/H(P) 确诊年龄 <60岁 ≥60岁1 8101 8423663371 0001 0594444460.700(0.482)浸润程度 黏膜层100175825 肌层 纤维膜7882 6791465234361 5182066381.770(0.621) 纤维膜外85174721淋巴结转移 阴性 阳性1 9231 7293923111 1319284004904.618(<0.001)分化程度 高分化2954220647 中分化2 0743411 19054323.560(<0.001) 低分化1 283320663300病理分期 Ⅰ期130208624 Ⅱ期 Ⅲ期1 7791 5833662941 04185437243526.620(<0.001) Ⅳ期160237859

表2 不同临床病理特征女性食管鳞癌患者癌组织中E-cadherin表达的比较

男性患者中，分化程度低、淋巴结转移阳性、病理分期高的患者E-cadherin表达强于分化程度高、淋巴结转移阴性、病理分期低者(P<0.05)。女性患者中，淋巴结转移阳性、病理分期高的患者E-cadherin表达强于淋巴结转移阴性、病理分期低者(P<0.05)。

2.2术后预后影响因素分析Kaplan-Meier生存分析结果见表3、表4。男性患者中，E-cadherin不同表达组间生存曲线有差异，表达越强，中位生存期越短。而女性患者中，E-cadherin不同表达组间生存曲线差异无统计学意义。

Cox回归分析变量赋值见表5。回归分析结果(表6、7)显示： E-cadherin表达不是食管鳞癌女性患者术后预后的独立影响因素(P=0.089)，但是男性患者术后预后的独立危险因素(P<0.001)。

表3 不同临床病理特征男性食管癌患者的Kaplan-Meier生存分析

表4 不同临床病理特征女性食管癌患者的Kaplan-Meier生存曲线的比较

表5 变量赋值表

表6 食管鳞癌男性患者 术后预后影响因素的Cox回归分析结果

表7 食管鳞癌女性患者 术后预后影响因素的Cox回归分析结果

3 讨论

E-cadherin是钙黏蛋白家族成员，是一种重要的跨膜糖蛋白，其基因位于第16号染色体，其与连接素(α、β、γ-catenin)结合形成复合物，介导细胞间黏附，维持上皮组织结构和功能，被认为是细胞间黏附连接、维持细胞极性和组织完整性的重要蛋白[7]。E-cadherin表达低下导致的复合物功能障碍，可影响细胞间黏附。

肿瘤细胞分化程度降低，则极性丧失，细胞间连接减弱，容易发生转移，与肿瘤细胞的侵袭转移和预后不良有关[8]。本研究结果显示，E-cadherin表达与食管鳞癌的组织分化程度、淋巴结转移有关。但是Luo和Siitonen等[9-10]研究发现某些生物标记物在原发肿瘤和配对转移淋巴结组织中的表达并不一致，E-cadherin在转移淋巴结中的表达强于原发肿瘤组织。因此肿瘤组织中E-cadherin的表达与肿瘤侵袭、转移的关系还有待进一步研究。

研究[11-13]证实，E-cadherin和连接素的共同作用与食管癌的预后相关。Ishiguro等[3]则认为癌组织中β-catenin的表达与食管癌患者的预后无关，而E-cadherin与β-catenin则协同起作用，影响食管癌患者的预后。因此，目前人们对E-cadherin表达评判食管癌预后的价值看法不一。本研究利用大样本、长时间随访数据，对癌组织中E-cadherin表达与食管鳞癌患者术后生存状况的关系进行了探讨，结果显示，E-cadherin阳性表达是男性食管鳞癌患者术后预后的独立危险因素，但不是女性患者的术后预后影响因素。多项研究[14-16]结果显示，女性食管鳞癌患者的术后生存状况优于男性，这一现象可能与女性体内激素水平、受体水平、婚育状态有关。

分子生物学指标是精准预防、精准治疗、个体化治疗的必然条件。本研究结果提示E-cadherin是男性食管鳞癌患者术后预后的独立影响因素，但其分子机制仍不清楚，有待进一步研究。此外单一指标能否对预后做出准确的判断，也值得进一步探讨。