2017年不同地区黄鸡中鸡传染性支气管炎病毒分离株N基因遗传进化分析

2019-04-02王占新鲁俊鹏

中国预防兽医学报 2019年1期

刘金，王占新，陈彤，鲁俊鹏

(温氏食品集团股份有限公司，广东云浮527439)

鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus，IBV)是单股正链RNA 病毒，属于冠状病毒科冠状病毒属第III 抗原群成员，主要在呼吸道和泌尿生殖系统复制。其编码的结构蛋白核衣壳蛋白(Nucleocapsid protein，N)参与病毒的复制与组装，与前导RNA 序列的相互作用有助于病毒mRNA 的合成，同时与RNA 结合形成螺旋状核衣壳[1-4]。随着研究的深入，发现IBV N 蛋白与S 蛋白类似，同样具有抗原决定簇，存在免疫识别相关位点，它的T 细胞表位蛋白能够诱导细胞免疫和体液免疫[5-6]。同时，以前认为高度保守的N 基因，随着免疫压力、基因突变、基因重组等原因，也在不断改变[7-10]。因此，了解IBV N 基因在黄羽肉鸡中的遗传进化规律，对IBV 分子流行病学研究具有重要意义。本研究对2017年从我国广西、云南、山东等地黄羽肉鸡中分离鉴定的IBV 株进行N 基因克隆、测序及分析，探究其在黄羽肉鸡中的分子流行病学和遗传变异特征。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 16 株IBV 分离株由本实验室于2017年分离自广西、云南、山东等地(表1)。一步法RT-PCR 反应试剂、DNA Marker 购自宝生物工程(大连)有限公司；Magen RNA 提取试剂盒购自Magen 生物；SPF 鸡胚购自广东温氏新兴大华农禽蛋公司SPF 实验动物中心。

表1 2017年从国内分离的16 株IBV 背景Table 1 Backgrounds of 16 IBVs isolated in China in 2017

1.2 引物设计与合成应用Primer5.0 软件，参照GenBank 中登录的IBV N 基因序列(GU393335)，设计1 对特异性引物，序列如下：IBVNF：GTGTGGT AGGCGAGTGCTTTTA； IBVNR： GGCGTCCTAGT GCTGTAC，引物由华大基因公司合成，目的片段长度约为1 900 bp。

1.3 IBV 的增殖与RNA 抽提将16 株IBV 分别经尿囊腔接种于10 日龄SPF 鸡胚，37 ℃培养48 h 后无菌收取尿囊液，-70 ℃保存备用。按照Magen RNA 抽提试剂盒说明方法提取病毒RNA。

1.4 IBV N 基因的扩增及测序以提取的病毒RNA 为模板，应用RT-PCR 方法对各病毒株的N 基因进行扩增，扩增程序：50 ℃30 min；94 ℃5 min；94 ℃30 s、55 ℃30 s、72 ℃2 min，共35 个循环；72 ℃10 min。反应结束后，PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测，阳性PCR 产物由华大基因公司测序。

1.5 N 基因核苷酸序列及其推导氨基酸序列分析将测序后的16 株IBV N 基因序列采用Mega5.0、DNAStar 软件进行核苷酸序列及推导氨基酸序列分析。

2 结果与讨论

2.1 N 基因的扩增、测序及分析 16 株IBV 分离株均扩增出约为1 900 bp 的目的片段。对16 株分离株进行测序分析，结果显示：16 株分离株N 基因全长均为1 230 bp，编码409 个氨基酸，未出现碱基缺失和插入。采用MEGA5.0 和DNAStar 软件对各分离株N 基因核苷酸序列与参考病毒株进行比对分析。16 株IBV 分离株之间N 基因序列同源性为85.9 %～99.9 %，其中SDGM-DHJ、YNSL-AYF、SDGM-CYG 等3 株与疫苗株H120 参考株同源性较高为99.8 %～99.9 %，与其余13 株分离株同源性均小于91.2 %；16 株IBV 分离株之间推导氨基酸同源性为89 %～99.8 % ，其中SDGM-DHJ 与YNSL-AYF 推导氨基酸同源性为99.8 %，同源性较高。以H120 疫苗株为参考株，由核苷酸突变导致氨基酸改变区域主要集中在aa4 ～aa16、aa38 ～aa50、aa64、aa117～aa125、aa209～aa237、aa334～aa366。表明随着IBV 的流行，其N 基因也出现一定的变异。

2.2 N 基因遗传进化分析应用MEGA5.0 软件可将所分离的16 株IBV 分离株的N 基因分为3 个大群，12 株分离株属于QX-Like 型，1 株分离株属于4/91-Like 型，3 株属于Mass-Like 型(图1)。表明N基因在我国存在多种基因型，但在我国部分地区黄羽肉鸡中主要以QX-Like 型为主，这可能与我国目前IBV 流行株为QX 型有关[7-8]。

图1 16 株IBV 分离株N 基因进化树分析Fig.1 Phylogenetic tree based on the N gene of the 16 IBV isolates

2.3 IBV N 蛋白3 个保守碱性氨基酸区序列分析以IBV H120、变异株4/91、QX 为参考株，对16 株IBV 分离株N 蛋白的3 个保守碱性氨基酸区序列进行分析。结果显示：以H120 疫苗株为参考株，SDGM-DHJ 与YNSL-AYF 与H120 株在3 个碱性氨基酸区无氨基酸替换与突变，GXLC-WXQ 分别在77 位(Y-F)、192 位(A-S)、342-343 位(PN-SS)、360位(Q-P)出现氨基酸突变；以4/91 为参考株，SDGM-CYG 在3 个氨基酸保守区域无氨基酸替换与突变；以QX 型为参考株的13 株分离病毒株，在aa79 ～aa80，aa189 ～aa190、aa192 ～aa195，aa223，aa334～aa336，aa342～aa343，aa345，aa350～aa351，aa360 等均出现不同程度的氨基酸突变(表2)。表明IBV N 蛋白3 个保守碱性氨基酸区的保守性也产生了一定的突变，这些突变可能会改变IBV 诱导宿主B 淋巴细胞，以及机体对IBV 的CTL 反应。

近年来的研究表明，N 基因存在某些抗原表位及功能区域[11]，N 基因的核苷酸点突变以及由此导致的氨基酸残基的改变可能导致IBV 生物学特性改变及IBV 发生变异。因此，针对IBV 流行株N 基因的遗传变异研究，对阐明IBV 基因组的遗传进化及其分子流行病学特征具有重要作用。