旋毛虫ES抗原对小鼠腹腔巨噬细胞NOD1受体通路影响的研究

李晓云，韩彩霞，阴 玥，胡 静，张 妍，孟 诗，孟小晴，宋铭忻

(东北农业大学动物源性人兽共患病黑龙江省重点实验室，黑龙江哈尔滨150030)

旋毛虫病是由旋毛虫感染引起的一种严重的人畜共患寄生虫病，主要病征是发热，肌肉炎症性疼痛，四肢酸困无力等，严重者可因心肌炎等并发症导致死亡[1]。宿主被感染的过程中虫体可产生各类抗原，其中排泄分泌(Excretory-secretory，ES)抗原，直接暴露于宿主免疫系统，是诱导宿主产生免疫应答反应的主要靶抗原[2]。宿主天然免疫系统通过模式识别受体在第一时间发现、识别并抵抗病原体的入侵。其中NOD1 受体作为模式识别受体家族NLRs 中一种重要的天然免疫受体，广泛存在于多种组织细胞中[3-4]。一般NOD1 受体被病原体激活后可活化下游的效应分子RIP2，能够引起caspase-1、NF-κB、MAPKs 等信号通路被激活，诱导TNF-α、IL-1β 和IL-6 等炎性因子分泌，进而引起多种免疫应答反应[5]。目前NOD1 受体的研究主要集中在细菌感染方面[6-8]，关于NLRs 在寄生虫感染中作用的研究相对较少，且主要集中在原虫感染方面[9-11]，在线虫感染方面的报道鲜见。

本实验通过旋毛虫肌幼虫ES 抗原体外作用于健康小鼠腹腔巨噬细胞，观察NOD1 受体与其信号通路中关键分子以及相关细胞因子的表达动态，初步探究了旋毛虫ES 抗原对宿主巨噬细胞NOD1 受体通路的影响。应用荧光定量PCR 对细胞内NOD1、RIP2 和NF-κB 基因转录水平进行监测，western blot 对细胞内NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65 表达量进行测定，ELISA 测定细胞培养上清中TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量的变化，探究旋毛虫与宿主天然免疫系统相互作用的机制，为临床旋毛虫病的防治和了解旋毛虫对宿主的感染机制提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 虫种与实验动物 黑龙江猪旋毛虫虫株由本实验室传代保存，2 月龄昆明系小鼠，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。

1.2 主要试剂 rTaq聚合酶、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、pMD18-T 载体、DH5α 感受态细胞、TRIzol、MLV和RRI，均购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒提取、胶回收试剂盒、兔源β-actin 内参MAb 和辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG (IgG-HRP)二抗均购自北京全式金生物技术有限公司；兔源NOD1 单克隆抗体(MAb)、RIP2 MAb、NF-κB p65 MAb 和NF-κB p-p65 MAb 均购自北京博奥森公司；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-6 ELISA 检测试剂盒均购自北京诚林生物科技有限公司；RIPA 裂解液为碧云天产品。

1.3 旋毛虫ES 抗原的制备 取本实验室保种的旋毛虫肌幼虫，每只鼠经口喂入200 条幼虫使之感染，在感染后的35 d 迫杀小鼠，取其肌肉搅碎并按比例加入人工胃液消化4 h，消化液中加入清水反复洗涤沉淀，收集底层虫体。收集的虫体用含双抗的灭菌生理盐水清洗5 次，加入到1640 培养基中，密度为5 000 条/mL，37 ℃5 % CO2培养24 h。收集培养液离心后将上清液装入透析袋中透析，然后用PEG 5000 浓缩，所得ES 抗原经0.22 μm 滤器过滤后应用SDS-PAGE 进行检测，并测定蛋白含量，保存于-20 ℃备用。

1.4 旋毛虫ES 抗原对小鼠腹腔巨噬细胞活力的影响 取健康的小鼠脱颈处死，无菌腹腔注射5 mL已提前预冷的1640 培养液，轻柔小鼠腹部5 min 后吸出灌洗液，并将不同小鼠的腹腔巨噬细胞均匀混和在一起，贴壁培养2 h 后，用细胞刮刀刮取，计数，按1×106个细胞/ 孔接种于六孔板。加入ES 抗原使其浓度分别为0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL、25 μg/mL 和40 μg/mL，同时设置重复孔，培养12 h 后应用台盼蓝染色法分别计算各浓度作用下的活巨噬细胞数。

1.5 不同浓度ES 抗原对小鼠腹腔巨噬细胞NOD1转录水平的影响 将腹腔巨噬细胞按1×106个细胞/孔接种于六孔培养板中，每孔接种2 mL，肌幼虫ES 抗原按浓度梯度0、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL 和25 μg/mL 与巨噬细胞作用12 h，每组设置重复孔。培养结束后，应用TRIzol 法提取巨噬细胞总RNA，反转录合成cDNA，利用文献[12]中的荧光定量PCR 方法检测NOD1、RIP2、NF-κB mRNA 转录水平。

1.6 ES 抗原诱导小鼠腹腔巨噬细胞NOD1 转录的时间效应 按步骤1.5 确定好的ES 抗原剂量作用于巨噬细胞，测定时间对NOD1 mRNA 转录水平的影响。将巨噬细胞按1×106个细胞/ 孔接种于六孔培养板中，每孔接种2 mL，ES 抗原按时间梯度(0、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、24 h)作用于巨噬细胞，每组设置重复孔。培养结束后，同步骤1.5 对巨噬细胞中NOD1、RIP2、NF-κB mRNA 转录水平进行荧光定量PCR 检测[12]。

1.7 Western blot 检测ES 抗原对小鼠腹腔巨噬细胞NOD1、RIP2、NF-κB p65 和NF-κB p-p65 蛋白表达量的影响 按1.5 确定的ES 抗原浓度，1.6确定的作用时间，与小鼠腹腔巨噬细胞共培养，同时设置空白对照组(PBS 组)和ES 抗原组，每组设置重复孔。细胞培养结束后，加入PMSF 的RIPA 裂解液处理细胞，提取其总蛋白，分别以NOD1、RIP2、NF-κB p65 和NF-κB p-p65 兔源MAb 为一抗(1∶5 000)，羊抗兔HRP-IgG (1∶10 000)为二抗，利用western blot 检测NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65 蛋白水平。

1.8 ELISA 测定巨噬细胞培养上清中细胞因子含量取步骤1.7 所得小鼠腹腔巨噬细胞培养上清液，应用ELISA 试剂盒按说明书操作对其中细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量进行测定。

1.9 数据分析 应用 EXCEL、 ABI7500Fast、SPSS21.0、Image J 和GraphPad Prism 5 对试验数据进行统计分析。

2 结 果

2.1 旋毛虫ES 抗原的制备 将收集的肌幼虫于1640 培养基中培养，获取旋毛虫ES 抗原，所得培养液经透析、浓缩、过滤并测定蛋白含量后，应用SDS-PAGE 检测ES 抗原的制备和收集情况，结果显示目的蛋白条带主要位于43 ku ～53 ku (图1)，表明制备的ES 抗原质量较好。

图1 ES 抗原的SDS-PAGE 分析Fig.1 Detection of ES antigen expression by SDS-PAGE

2.2 旋毛虫ES 抗原对小鼠腹腔巨噬细胞活力的影响 取健康小鼠腹腔巨噬细胞与不同浓度ES 抗原共同培养12 h 后应用台盼蓝染色法检测，结果显示当ES 抗原浓度在0～20 μg/mL 时，对细胞活力影响不大，当浓度达到并高于25 μg/mL 后，细胞活力明显下降(p＜0.01)(图2)。表明ES 抗原在低于25 μg/mL 时，不会影响巨噬细胞活力。

图2 ES 抗原浓度对巨噬细胞活力的影响Fig.2 The effects of ES concentration on macrophages vitality

2.3 不同浓度ES 抗原对小鼠腹腔巨噬细胞NOD1、RIP2 和NF-κB 转录水平的影响 将小鼠腹腔巨噬细胞与不同浓度(在一定范围内梯度增加)的旋毛虫ES 抗原共同培养一定时间，检测ES 抗原浓度对巨噬细胞中各目的基因mRNA 转录水平的影响。结果显示，随着浓度增加，各目的基因转录水平在抗原浓度为15 μg/mL 时均达到最大值，分别为对照组转录水平的2.0 倍，3.6 倍和2.5 倍，之后mRNA 转录水平逐渐下降，不再随ES 抗原浓度的增加而增加(图3)。表明旋毛虫ES 抗原可以引起巨噬细胞各目的基因转录水平升高，但超过一定浓度的ES 抗原刺激导致细胞出现一定程度的免疫抑制。所以后续实验选择15 μg/mL 作为ES 抗原与巨噬细胞相互作用浓度。

图3 筛选ES 抗原诱导小鼠腹腔巨噬细胞NOD1、RIP2 和NF-κB 表达的最适剂量(n=5)Fig.3 Dose-effects of ES antigen on the transcription of NOD1,RIP2 and NF-κB in peritoneal macrophage from mice (n=5)

2.4 ES 抗原诱导小鼠腹腔巨噬细胞NOD1、RIP2和NF-κB 转录的时间效应 将小鼠腹腔巨噬细胞与15 μg/mL 的旋毛虫ES 抗原作用不同时间，检测作用时间对细胞各目的基因mRNA 水平的影响。结果显示，随着时间的增加，NOD1、RIP2 和NF-κB mRNA 水平先逐渐升高，分别于9 h、9 h 和12 h 时达到最高值，分别为作用前的2.0 倍、3.2 倍和3.3倍，之后各目的基因mRNA 水平逐渐下降，不再随作用时间的增加而增加，24 h 时NOD1 mRNA 已显著低于作用前的mRNA 水平(p＜0.01)(图4)。表明旋毛虫ES 抗原能够诱导巨噬细胞各目的基因mRNA 水平升高，但当作用时间超过一定值时亦可引起免疫耐受。在相同ES 抗原作用浓度时，后续实验选择9 h 作为相互作用时间。

2.5 Western blot 检测ES 抗原对小鼠腹腔巨噬细胞NOD1、RIP2、NFκB p65、NF-κB p-p65 蛋白表达的影响 将浓度为15 μg/mL ES 抗原作用于腹腔巨噬细胞9 h 后，收集巨噬细胞提取总蛋白，采用western blot 检测各目的基因蛋白表达水平。结果显示巨噬细胞中NOD1、RIP2 和NF-κB p-p65 的蛋白表达量均显著增加，与对照组比差异极显著(p＜0.01)，NF-κB p65 表达量与对照组比较则显著减少(p＜0.05)，可能是由于NF-κB p65 被激活并磷酸化转入细胞核内，表现为与NF-κB p-p65 呈反向表达(图5)。表明巨噬细胞在ES 抗原刺激下，各目的基因蛋白(除NF-κB p65 外)表达量升高，与荧光定量PCR 检测mRNA 结果基本一致，在蛋白水平上进一步验证了ES 抗原对巨噬细胞NOD1 受体通路的影响。

图4 ES 抗原诱导小鼠腹腔巨噬细胞NOD1、RIP2 和NF-κB表达的时间效应Fig.4 Time-effects of ES antigen on the transcription of NOD1,RIP2 and NF-κB in peritoneal macrophage from mice

图5 Western blot 检测巨噬细胞中各目的基因蛋白表达量Fig.5 Detection of protein expressions of target genes in macrophages by western blot

2.6 ELISA 测定巨噬细胞培养上清中细胞因子含量采用浓度15 μg/mL 的ES 抗原作用小鼠腹腔巨噬细胞9 h 后，ELISA 测定炎性因子的含量。结果显示各炎性因子TNF-α、IL-1β、L-6 的含量均显著升高，与对照组相比差异极显著(p＜0.01)(表1)。表明ES抗原能够促进炎性因子分泌，另也表明ES 抗原对小鼠腹腔巨噬细胞NOD1 受体通路的影响。

3 讨论

旋毛虫在宿主体内的不同发育时期，均可以通过ES 抗原与宿主免疫系统相互作用[2]。由于肌幼虫期是旋毛虫主要的致病时期，并且肌幼虫排泄分泌抗原较易制备，因此本实验选择旋毛虫肌幼虫ES 抗原来探究其对宿主巨噬细胞NOD1 受体通路的影响。

随着近年来对固有免疫系统识别病原体抗原机制的深入了解，由细胞编码的病原识别受体家族逐渐被发现并被普遍接受[13]。NOD 样受体作为一种胞内模式识别受体，其通过识别侵入细胞的内部信号来调控机体的天然免疫系统。有研究表明，NLRs在抵御寄生虫对宿主的入侵有关键作用[9-11]，其在线虫感染中作用的相关研究鲜见报道。Ilic 等应用旋毛虫ES 抗原与人胚肾细胞(HEK-BlueTM)的模式识别受体(PRRs)相互作用，将HEK-hNOD1 细胞与ES 抗原共同培养4 h 和24 h 后，SEAP (分泌型碱性磷酸酶)活性水平与对照细胞相比变化不明显，表明人胚肾细胞NOD1 受体没有参与ES 抗原介导的相互作用[14]。在本实验中旋毛虫ES 抗原是如何调控激活巨噬细胞NOD1 受体通路，是否与受体细胞及ES 抗原剂量等的差异有关，其作用机制还需要深入的研究。

表1 巨噬细胞培养上清中TNF-α、IL-1β、IL-6 含量的检测(n=5)Table 1 The levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 in supernatant of cultured macrophages (n=5)

荧光定量PCR 检测巨噬细胞NOD1、RIP2 和NF-κB 基因转录水平结果表明，细胞中NOD1、RIP2 和NF-κB mRNA 水平对ES 抗原均呈现一定的时间和剂量依赖性，但当作用时间和作用浓度超过一定值时，各目的基因mRNA 转录水平均表现为下降趋势，甚至低于对照组，表明ES 抗原诱导小鼠腹腔巨噬细胞出现了免疫耐受现象。Western blot 测定细胞内NOD1、RIP2、NF-κB p65、NF-κB p-p65蛋白表达量，ELISA 测定细胞培养上清中炎性因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 含量变化，均与荧光定量PCR结果相似，从另一角度说明旋毛虫ES 抗原可以激活并调节巨噬细胞NOD1 受体通路，使细胞内NOD1、RIP2 和NF-κB p-p65 蛋白表达量增加，细胞因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 分泌量增多。以上实验结果表明旋毛虫肌幼虫ES 抗原在一定的剂量和时间，可以激活并调节小鼠腹腔巨噬细胞中NOD1受体通路，上调NOD1 受体通路中关键分子RIP2和下游分子NF-κB 的表达，促进细胞因子TNF-α 和IL-6 的分泌；同时也表明，ES 抗原在超过一定的时间和浓度可以导致NOD1 受体免疫抑制。由于ES抗原成分及与宿主免疫反应的复杂性，其具体作用机制还需进一步的研究。