海南牛乳源链球菌的分离鉴定及特性分析

王 宇，郭桂英，张智勇，秦 烨，蒲文渊，杨 诺，李 迁，曾纪锋*，郑继平*

(1.海南大学热带农林学院/ 海南大学教务处/ 海南大学网络与技术中心，海南海口570228；2.海南艾森乳业有限公司，海南澄迈571925)

奶牛乳房炎(Mastitis)是一种全球性的奶牛疾病，可分为临床型乳房炎和隐性乳房炎。其中隐性乳房炎占乳房炎70 %以上，常导致牛奶产量和质量下降，造成奶牛养殖业的重大经济损失[1]。引起奶牛乳房炎的因素复杂多样，其中链球菌(Streptococcus)的感染极为重要[2]，其主要种类有无乳链球菌(S.agalactiae)、乳房链球菌(S.uberis)及停乳链球菌(S.dysgalactiae)等。近年来，由于无乳链球菌对人、鱼、牛的严重危害而倍受重视[3-4]；但对乳房链球菌的研究仍不深入，对其毒力因子、致病机理和耐药机制等方面仍知之甚少。合理使用抗生素是治疗奶牛乳房炎的有效手段，但定期筛查病原菌的耐药性仍然是奶牛乳房炎防治措施中重要的一环。

海南地区属亚热带岛屿，气候条件高温多湿，与大陆的天然隔断使该地区病原具有其独特性，因此对海南地区牛源链球菌的研究具有重要意义。本研究对海南澄迈地区某奶牛场牛源链球菌进行分离鉴定，并进行耐药性分析和毒力因子的检测，为海南地区链球菌引发奶牛乳房炎的防治提供参考。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 脑心浸出液(BHI)培养基购自英国OXIOD 公司、链球菌显色培养基购自法国Chromagar 公司；细菌生化微量鉴定管和药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司；2×A8 Fast HiFi PCR Master Mix、DL2000 DNA Marker、PCR 产物纯化回收试剂盒，购自北京艾德莱生物科技有限公司；细菌基因组DNA 提取试剂盒(Bacterial DNA Isolation Kit)， 购自北京华越洋生物科技有限公司；金黄色葡萄球(Staphylococcusaureus)ATCC25923 购自中国兽医药品监察所；乳质体细胞测定仪，购自Dairy Quality 公司。

1.2 乳样来源及采集方法 2017年12 月，从海南澄迈地区1 个奶牛场抽样采集了67 头奶牛的乳样。67 头泌乳奶牛均临床健康，无乳腺炎临床症状，但乳汁经乳质体细胞测定仪检测，体细胞数(SCC)均高于50×104个/mL，初步判断奶牛患有隐性乳房炎。采样时先用清水清洗奶牛乳头，再用碘伏消毒，最后用灭菌毛巾擦干，每头奶牛采集乳汁5 mL(舍弃头两把乳)装于无菌EP 管中，样品低温存储送回实验室培养。

1.3 细菌的分离与纯化 利用链球菌显色培养基接种乳样，培养出来的单菌落革兰氏染色镜检后对分离到的链球菌编号，并记录菌株分离时间、分离地点等。

1.4 分离菌生化鉴定和分子鉴定 根据初步分离纯化结果，对革兰氏染色为链球状的菌株做进一步的生化鉴定，依据《常见细菌系统鉴定手册》 确定链球状菌所属的种。按照细菌基因组DNA 提取试剂盒的说明书，提取细菌基因组DNA，采用细菌16S rRNA 通用引物(27F： 5'-AGAGTTTGATCCTGGCT CAG-3'/1429R： 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')；PCR 扩增其16S rRNA 基因。扩增程序：94 ℃3 min；93 ℃30 s、54 ℃30 s、72 ℃1 min，30 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物纯化后由北京六合华大基因科技有限公司测序，对测序结果进行BLAST 分析，并使用MEGA6.05 构建其系统发育树。

1.5 分离菌的药敏试验 按照Kirby-Bauer(K-B)纸片扩散法对分离菌进行药敏试验，以金黄色葡萄球菌ATCC25923 为药敏质控菌株，参照美国临床实验室标准委员会(NCCLS2017)推荐标准判断分离菌的抑菌结果。

1.6 分离菌的毒力基因检测 参考文献[5-9]中引物及方法， PCR 扩增分离的乳房链球菌的11 种毒力基因。11 种毒力基因分别为：透明质酸荚膜基因(hasA/hasB/hasC)、 纤溶酶原激活物蛋白基因(pauA/skc)、表面脱氢酶蛋白基因(gapC)、CAMP 因子基因(cfu)、乳铁蛋白结合蛋白基因(lbp)、细菌肽转运蛋白基因(oppF)、一种脂蛋白受体抗原基因(mtuA)、粘附蛋白基因(sua)。引物由北京天一辉远生物科技有限公司合成。

2 结果与讨论

2.1 分离菌的形态特征 从67 份乳样中共分离到20 株链球菌，其中16 株在BHI 琼脂培养基上形成直径约1 mm，隆起，圆形，边缘整齐且闪光的菌落，显微镜观察菌体形态为长链状(图1)，将其命名为U1～U16；另外4 株菌在BHI 琼脂培养基上形成直径约1.5 mm，隆起，圆形呈露珠状的菌落，显微镜观察菌体形态为短链状(图1)，将其命名为P1～P4。

2.2 分离菌的生化鉴定结果 分离菌染色镜检结果显示为链球状，且触酶试验为阴性，则鉴定分离菌为链球菌。根据生理生化反应结果，依据《常见细菌系统鉴定手册》可认定16 株长链链球菌符合乳房链球菌的生理生化特性，4 株短链链球菌符合巴氏链球菌(S.pasteurianus)的生理生化特性见表1。

图1 分离菌形态特征Fig.1 Morphological characteristics of Streptococcus isolates

表1 分离菌的生理生化鉴定Table 1 Physiological and biochemical test of the isolates

2.3 分离菌16S rRNA 基因的PCR 扩增及进化分析 对上述链球菌16S rRNA 基因的PCR 扩增结果显示在约1 500 bp 处有目的条带。PCR 产物纯化测序后经Blast 比对显示，16 株长链链球菌与乳房链球菌的同源性≥98 %，4 株短链链球菌与巴氏链球菌的同源性≥98 %。采用16S rRNA 基因序列绘制系统发育树，结果显示分离菌与乳房链球菌的亲缘关系最近(图2)，进一步表明分离株为乳房链球菌。因本次是针对引起海南奶牛乳房炎链球菌的调查分析，巴氏链球菌并不能引起奶牛乳房炎，而且该菌以前被称为2 型牛链球菌[10]，是许多草食动物胃肠道内的一种无害细菌，所以不对巴氏链球菌的特性进行分析。

图2 乳房链球菌16S rRNA 的进化树Fig.2 Cladogram of S.uberis based on 16S rRNA gene sequences

2.4 分离菌毒力基因鉴定结果 对分离的乳房链球菌11 种毒力基因的PCR 鉴定结果显示除lbp基因(31.25 %，5/16)外，hasA、hasB、hasC、mtuA、gapC、sua、pauA、skc、oppF、cfu基因的发生频率均为100 %。在以往报道中[11-13]，乳房链球菌个别毒力因子高频发生，但大规模毒力因子同时高频发生的现象并未见报道。本次研究结果显示海南的乳房链球菌，不仅有10 种毒力因子发生频率高达100%，而且毒力模式罕见，与国内外报道显著不同[11-14]。目前国内研究链球菌的毒力因子主要以猪链球菌(S.suis)、无乳链球菌(S.agalactiae)、副肺炎链球菌(S.paraubueris)为主，少有乳房链球菌毒力因子的研究，结果也并不够精确。在国外对于核苷酸和氨基酸水平高度保守的毒力基因gapC、sua、pauA、skc被认为是开发疫苗的良好靶标[8,15-16]。对于猜测与乳房炎发病机制和感染有关的hasA、hasB、hasC、oppF、mtuA 基因，在不同地区与乳房炎相关的分离菌株中这些基因的发生频率会明显升高，个别基因发生频率可达100 %。对于乳房链球菌生长非必须的cfu、lbp基因，其范围可从波兰[12]的lbp(0)和cfu(19 %)到泰国[11]的lbp(78.41 %)、印度[13]的cfu(85.7 %)。本实验结果显示无论是保守的毒力基因还是与发病相关的毒力基因均100 %存在，且与生长无关的cfu基因也高频发生，这样的毒力模式非常少见，为国内外首次报道。乳房链球菌存在如此全面的毒力因子，表明奶牛场中存在一些强毒力和高度传播的乳房链球菌优势菌株，也许这些优势菌株借助其毒力基因，逃避或减弱宿主的免疫应答，从而增强其在宿主的存活率，提高对奶牛的感染率。目前研究不能解释奶牛乳房炎的发生与其毒力因子之间的相关性；但在乳房链球菌的人工致病试验中，证明菌株的毒力比接种剂量更重要[17]；已有的研究表明，某些在毒力方面具有优势的乳房链球菌比其它菌株更易在奶牛中生长以及侵入其乳腺上皮细胞[18]。本次海南奶牛乳腺链球菌的感染调查表明乳房链球菌是奶牛乳腺感染的主要菌种，而非经常报道的无乳链球菌，推测与乳房链球菌毒力因子发生频率的独特性有关。在后续调查研究中，本研究将扩大对该菌在海南不同地区的流行病学调查，以便更进一步证实以上推测。

2.5 分离菌的药敏试验结果 青霉素G 等β- 内酰胺类抗生素是奶牛场防治链球菌感染的常用药物。本次从奶样中分离得到的乳房链球菌对β-内酰胺类抗生素(青霉素类、头孢菌素类)仍然具有高度敏感性。此外本次分离得到的乳房链球菌对氨基糖苷类、四环素类、多肽类、利福霉素类抗生素的耐药率较高(18.5 %～50 %)；特别是对链霉素、大观霉素、四环素的耐药率高达31.25 %～50 %，其次是庆大霉素、利福平等。对于乳房链球菌的多重耐药菌株，其中3 重耐药的菌株有4 株，其次为2 重耐药(3 株)和4 重耐药(2 株)，甚至各检测出1 株乳房链球菌出现了5 重耐药和6 重耐药的现象。虽然调查结果显示多重耐药菌株达68.75 %，但菌株依然对β- 内酰胺类药物、磺胺类药物具有100 %敏感性。因此，牛场在用药治疗时可以根据药敏试验结果，选择有效的抗菌药物，合理或交替使用，以减少耐药菌株的出现。其药敏结果详见表2。

总之，本研究结果表明，乳房链球菌是本次奶牛乳腺链球菌感染调查的主要链球菌，同时该菌具有多重耐药性且毒力因子发生频率独特。调查结果为海南牛源链球菌的防治提供依据；牛场在乳腺链球菌感染用药防治时要参照药敏结果，选择有效药物治疗，同时奶牛的合理饲养和管理也必不可少。

表2 乳房链球菌的药敏试验Table 2 Drug sensitivity test of the S.uberis