茶花鸡MHC单倍型及其对HPAI免疫应答水平影响的测定

郑玉芳，简宗辉，段锐锐，鲁琼芬，刘建平，陈培富*

(1.云南农业大学动物医学院，云南昆明650201；2.云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201；3.西双版纳傣族自治州畜牧技术推广工作站，云南西双版纳666100)

H5N1 高致病性禽流感(Highly pathogenic avian influenza，HPAI)是严重危害养禽业和人类健康的人兽共患病。目前中国的禽流感防制主要是采取捕杀并结合疫苗免疫的策略[1]。有国外学者报道红色原鸡(Gallus gallus)对H5N1 HPAI 具有较强的抵抗力[2]。茶花鸡作为滇南一带少数民族驯养红色原鸡形成的半野生鸡品种，并与后者存在基因交流，其继承了红色原鸡丰富的群体遗传多样性[3-5]，可能具有类似的遗传抗病特性。研究发现，已知主要组织相容性复合体(MHC)是决定动物抗病力的关键遗传因素，据此国外已培育出抗马立克病的鸡品系[6-7]。基于获得性免疫应答水平可视为动物抗病力的间接选择指标，有必要对接种HPAI 疫苗的茶花鸡测定其血清特异性抗体效价和效应T 细胞干扰素(IFN-γ)水平，以期找到代表HPAI 抗性的MHC 单倍型或基因型。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1 亚型Re-5 株)为乾元浩生物股份有限公司生产；AIV H5 亚型血凝抑制试验抗原由哈尔滨维科生物技术开发公司生产；293 只健康脱温茶花鸡由云南省西双版纳茶花鸡保种场核心群繁殖，为同一批孵化，饲养条件相同，均仅在1 日龄接种马立克疫苗，90 日龄后独立饲养；IFN-γ ELISA 检测试剂盒Chicken IFN-γ CytoSetTMCatalog#CAC1233 购自Invitrogen 公司。

1.2 引物的设计 根据GenBanK 提供的鸡MHC 参考基因序列Z83781 设计引物(表1)，由昆明擎科生物合成。其中，LEI0258-F/LEI0258-R 为微卫星LEI0258 扩增引物，MCW0371-F/MCW0371-R 为微卫星MCW0371 扩增引物。

表1 实验用引物序列Table 1 The sequence of primers used in the experiment

1.3 实验动物免疫及采血 对293 只健康脱温茶花鸡分别于35 日龄和53 日龄接种同一HPAI 灭活疫苗(H5N1 亚型Re-5 株)(0.4 mL/ 只)，二免前1 d、二免后7 d 均采集翅下静脉全血约2 mL，自然沉降1 h～2 h，分离血浆和血细胞，-20 ℃保存。

1.4 血浆抗体效价检测 参考《中华人民共和国国家标准高致病性禽流感诊断技术》 GB/T 18936-2003，采用HA-HI 检测二免前、后的血浆中禽流感抗体效价。采用血凝抑制试验检测血浆中H5N1 抗体效价，判定茶花鸡的体液免疫应答水平。

1.5 血浆IFN-γ 水平检测 利用IFN-γ ELISA 检测试剂盒检测茶花鸡血浆中IFN-γ 水平，测定OD450nm值，并绘制标准曲线的直线回归方程y=0.0002x+0.0386，R2=0.9963，根据样品的OD450nm值用回归方程计算对应样品的IFN-γ 的浓度，判定细胞免疫应答水平。

1.6 茶花鸡微卫星的扩增及测序分析 提取1.3 中采集全血的鸡红细胞基因组DNA，以此为模板，分别以LEI0258-F/LEI0258-R和MWC0371-F/MWC0371-R为引物配制30 μL 体系，体系组成为：ddH2O 21 μL、10×PCR Buffer (Mg2+)3 μL、2.5 mmol/mL dNTP 2.5 μL、rTaqDNA 聚合酶0.5 μL、上、下游引物各0.5 μL、DNA 模板2 μL。PCR 扩增程序为：94 ℃5 min；94 ℃30 s、58 ℃40 s、72 ℃40 s，35 个循环；72 ℃10 min。产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物回收纯化后克隆至pMD19-T 载体，阳性克隆由上海生工生物工程技术服务有限公司测序，所获核酸序列利用Blast 做在线比对分析。

1.7 茶花鸡MHC 分型 参考Fulton 通过PCR 扩增获得的微卫星LEI0258 和MCW0371 片段大小与MHC 单倍型的对应关系，对本实验的茶花鸡进行MHC 分型。首先筛选出微卫星LEI0258 和MCW0371片段大小均可以与已确定的标准对应的MHC 纯合子组；若两个微卫星不能一一对应的，则筛选出个体之间同一微卫星序列无重复的LEI0258 特定扩增片段携带组。

1.8 统计学分析 筛选出个体数量大于或等于5 且已分型成功的微卫星LEI0258 携带组和MHC 纯合子组，利用SPSS 22.0 软件分别对微卫星LEI0258携带组和MHC 纯合子组与对应的二免前、后特异性抗体效价和IFN-γ 水平做单因素方差分析。结合单因素方差分析结果，p≤0.05 的判为有显著性差异，再在其组内做多组间比较；p＞0.05 的判为不存在显著性差异。随后，筛选出HPAI 免疫应答水平较高的微卫星LEI0258 特定片段携带组和MHC 纯合子组。

2 结 果

2.1 微卫星长度多态性检测结果 本研究针对293只茶花鸡，采用常规PCR 扩增微卫星LEI0258(182 bp～587 bp)，其中两条带的为MHC 杂合子，条带单一的应为纯合子(图1)；PCR 扩增微卫星MCW0371，大小在199 bp～211 bp(图2)。共获得50 种LEI0258长度多态性片段(表2)，4 种单倍纯合子，即MHC基因型(表3)，表明微卫星长度多态性丰富。

图1 部分茶花鸡LEI0258 扩增产物Fig.1 Amplication of LEI0258 in some chickens by PCR

2.2 LEI0258 片段长度与免疫应答水平相关性分析本实验从已测得的50 种LEI0258 片段中，选个体数(频数)≥5，且微卫星扩增片段之间无相互重复的9组LEI0258 特定扩增片段携带组(205 bp 组，217 bp组，249 bp 组，283 bp 组，292 bp 组，307 bp 组，319 bp 组，357 bp 组，391 bp 组)，分别对二免前、后抗体效价做单因素方差分析，结果显示LEI0258特定扩增片段携带组二免前血浆抗体效价差异总体不显著(p=0.056＞0.05)；二免后血浆抗体效价差异总体极显著(p=0.006＜0.01)，其中249 bp、307 bp、319 bp片段携带组抗体效价分别显著高于其它6 组的平均值(图3)。表明携带不同LEI0258 片段的茶花鸡个体对HPAI 疫苗的抗体应答水平存在差异。

图2 部分茶花鸡MCW0371 扩增产物Fig.2 Amplication of MCW0371 in some chickens by PCR

表2 微卫星LEI0258 片段长度多态性Table 2 Length polymorphism fragments of microsatellite LEI0258

表3 MHC 基因型Table 3 MHC genotype

图3 9 组茶花鸡LEI0258 特定扩增片段携带组平均血浆抗体效价Fig.3 The average plasma antibody titer means of 9 groups carrying LEI0258 fragments in Chahua chickens

对茶花鸡血浆中IFN-γ 水平做单因素方差分析，结果显示LEI0258 特定扩增片段携带组二免前血浆IFN-γ 水平差异总体不显著(p=0.739＞0.05)；二免后血浆IFN-γ 水平差异总体极显著(p=0.009＜0.01)，249 bp、307 bp、319 bp 片段携带组IFN-γ 浓度分别显著高于其它6 组的平均值(图4)。表明携带不同LEI0258 片段的茶花鸡个体对HPAI 疫苗的细胞免疫应答水平存在差异。

图4 9 组茶花鸡LEI0258 特定扩增片段携带组平均血浆IFN-γ 水平Fig.4 The average plasma IFN-γ level means of the 9 groups carrying LEI0258 fragments in Chahua chickens

2.3 MHC 基因型与免疫应答水平相关性 取样本量≥5 的MHC 基因型，分别对二免前后血浆特异性抗体效价做单因素方差分析，结果显示MHC 基因型组间二免前血浆抗体效价差异总体不显著(p=0.864＞0.05)；二免后血浆抗体效价差异总体显著(p=0.035＜0.05)，B17 基因型抗体效价显著高于其它3 组的平均值(图5)。表明不同基因型的茶花鸡个体对HPAI 疫苗的抗体应答水平存在差异。

取样本量≥5 的MHC 基因型，分别对二免前、后血浆IFN-γ 水平做单因素方差分析，结果发现MHC 基因型组间二免前血浆IFN-γ 水平差异总体不显著(p=0.436＞0.05)；二免后血浆IFN-γ 水平差异总体显著(p=0.028＜0.05)，其中B17 基因型显著高于其它3 组的平均值(图6)。表明不同基因型茶花鸡个体对HPAI 疫苗的细胞免疫应答水平存在差异。

图5 4 个基因型携带者鸡平均血浆抗体效价Fig.5 The average plasma antibody titer means for 4 genotypes

图6 4 个基因型携带者鸡平均血浆IFN-γ 水平Fig.6 The average plasma IFN-γ level mean of 4 genotypes

3 讨 论

目前除哺乳动物外，鸡MHC 基因是人类较早研究并且了解最深入的脊椎类动物基因[8]。鸡MHC基因在免疫系统中发挥重要的作用，与对疾病的抵抗力有着密切的关系[9-10]。但只有完成MHC 的分型工作才能进一步鉴定MHC 的抗病遗传标记。通常认为，鉴定MHC 单倍型是开展遗传育种和抗病研究的基础。因此，建立行之有效的MHC 分型方法就显得极其重要。20 世纪80年代以来，已有多种技术被用于鸡MHC 分型研究，包括血清学反应、PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、单链构象多态性分析和DNA 测序等技术[11-13]。

有学者应用血清分型方法已完成部分纯合子鸡的MHC 分型工作，并据此获得MHC 单倍型与微卫星LEI0258 和MCW0371 的对应关系，因此可以参考这一对应关系，扩增这两个微卫星系列对MHC进行分型。本实验通过常规PCR 扩增微卫星LEI0258 和MCW0371，随后对扩增产物进行TA 克隆和DNA 测序，最后根据片段长度大小，完成对293 只西双版纳茶花鸡的MHC 单倍型分型。结果显示，PCR 扩增LEI0258 获得50 种长度多态性片段，包括已有报道被用于MHC 单倍型命名的20 种和新发现的30 种，其中频率较高的为205 bp (49.66 %)、292 bp(12.14%)、391 bp(11.56%)、357 bp(10.20%)；而包括182 bp、209 bp、213 bp 等在内的19 种LEI0258 片段均仅出现一次。另外，本实验获得的片段长度为206 bp、217 bp、247 bp、259 bp、283 bp、488 bp、489 bp 等已有学者报道[14-15]，证明本实验结果可靠。由此表明，微卫星LEI0258 扩增片段具有丰富的长度多态性，这就意味着与其它已报道的鸡品种相比，茶花鸡可能具有更丰富的MHC 单倍型多态性。MHC 的多态性能够反应出基因组水平的多态性，这种多态性对生物机体识别外来细菌、病毒和噬菌体能力及种群适应性起到重要作用[16-18]。但有少量已报道LEI0258 片段如420 bp、513 bp、539 bp在本茶花鸡实验群体中未检测到，可能由于基因漂移导致等位基因在该实验鸡群体中频率极低或者消失，这将会造成茶花鸡遗传资源无法弥补的流失，提示有必要做好茶花鸡的保种工作，避免其遗传资源的流失。

MHC 的重要作用在于对鸡免疫反应的调节，MHC 细胞表面蛋白在区分自身或非自身免疫中很关键。MHC 细胞表面抗原与外来抗原和其它免疫细胞相互作用时产生特异性免疫反应。 然而要使这些免疫反应有效，免疫系统细胞必须至少有一个单倍型，即MHC 局限性[19]。MHC 不但存在局限性，还存在个体差异性，本次实验茶花鸡免疫HPAI 疫苗后，不同LEI0258 片段携带组及MHC 基因型对疫苗的免疫应答存在明显的差异，主要是由于MHC的不同造成的。实验中用于分析的各LEI0258 特定片段携带组或基因型组之间的抗体效价和IFN-γ 水平差异总体均不显著，可能是由于免疫系统及其淋巴细胞必须在抗原刺激下才能完全发育成熟，但初次免疫时茶花鸡个体幼小，免疫器官可能还未发育成熟，另可能与存在母源抗体的干扰有关。二次免疫后，因首次免疫后产生的记忆淋巴细胞发挥关键作用，受抗原刺激后，记忆淋巴细胞能较快做出再次免疫应答，即产生抗体时间较短、抗体亲和力升高、抗体效价增高，这可能是二次免疫后LEI0258特定片段携带组或基因型组抗体效价和IFN-γ 水平差异显著的原因。LEI0258 特定扩增片段携带组和MHC 基因型二免前、后血浆抗体效价和IFN-γ 水平的单因素方差分析结果表明，在H5N1 弱毒疫苗的免疫刺激后，不同LEI0258 特定扩增片段携带者和MHC 基因型的免疫应答水平存在差异，其中微卫星LEI0258 319 bp、249 bp、307 bp 携带者和B17 纯合子具有较高的HPAI 免疫应答水平。这可能对通过筛选免疫应答效果较好的LEI0258 特定扩增片段携带者和MHC 基因型来鉴定潜在的HPAI 抗性单倍型，具有重要的指引意义。对MHC 多态性或单倍型与疾病抗性关联的研究已成为开展抗病育种、发展预测和防控疾病新策略的一个热点，以最大程度减小由传染性疾病给养殖业带来的严重损失。本实验发现B17 单倍型可能代表对HPAI 的抗性，值得深入研究。