重组蛋白CTB-P97R1对猪支原体肺炎活疫苗滴鼻免疫效果的评价

韦艳娜，张珍珍，王 丽，王 佳，陈 蓉，冯志新，邵国青，熊祺琰

(江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，江苏南京210014)

猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)是猪支原体肺炎(俗称猪气喘病)的病原体，该病呈世界性分布，给养猪业造成严重的经济损失[1]。国内外大多采用疫苗防控该疾病，猪支原体肺炎168 株活疫苗由江苏省农业科学院兽医所研制，保护效率高于灭活疫苗，得到市场好评。目前国内市场上猪支原体肺炎活疫苗的免疫途径主要是胸腔注射(猪支原体肺炎Z 株活疫苗)或肺内注射(猪支原体肺炎168 株活疫苗)、滴鼻免疫(猪支原体肺炎RM48株活疫苗)，对于猪支原体肺炎168 株活疫苗而言肺内注射的免疫途径给猪场实际使用造成一定的不便，滴鼻、气雾免疫等黏膜免疫途径具有操作便利、动物应激小等优势，因此该免疫途径成为进一步研究该疫苗免疫效力的主要方向。

佐剂可提高疫苗免疫效果，为增加经滴鼻免疫途径的猪支原体肺炎168 株活疫苗的免疫效果，本研究拟开发一种适合于Mhp 活疫苗使用的黏膜佐剂。目前研究较多的黏膜佐剂包括壳聚糖、细菌毒素、CpG、PolyI:C、纳米乳等[2-3]。霍乱毒素B 亚单位(Cholera toxin subunit B，CTB)是霍乱肠毒素的无毒亚基，能够与大多数哺乳动物细胞表面的神经节苷脂(Monosialoganglioside，GM1)特异性结合，可使与其连接的抗原蛋白更易与黏膜作用，进而引起免疫机体一系列生理生化反应，使其产生更强的免疫效果[4]。Hou 等将CTB 作为黏膜佐剂与HIV-1 DNA疫苗联合后免疫小鼠可诱导其产生高水平的Th1 和Th2 型细胞因子、炎症细胞因子和趋化因子，同时提高血清中Env 蛋白的IgG 抗体水平[5]；Miyata 等将CTB 与蛋白MSP1-19 耦合可增强小鼠对疟原虫的抗感染作用，通过滴鼻和皮下注射，均可提高血清和支气管肺泡灌洗液中的IgG 抗体水平[6]。可见CTB 作为一种良好的黏膜免疫佐剂和抗原递送载体，可以用于增强疫苗的免疫效果。

P97 蛋白是目前研究最为深入的Mhp 表面黏附因子，其中的P97R1 (R1 区)是直接参与Mhp 黏附细胞的区域，也是其主要的抗原决定簇[7-8]，为少数被证明具备免疫保护能力的抗原之一[9-10]。基于此，本研究设计并表达了rCTB-P97R1 重组蛋白，将其与猪支原体肺炎活疫苗混合后滴鼻免疫小鼠，以评价其对该活疫苗黏膜免疫效果的增强作用。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料及实验动物 猪支原体肺炎(168株)活疫苗，批号20170518，由本实验室制备；含CTB 基因的重组质粒pET-CTB-p277 由中国药科大学微基因药物实验室惠赠[11]；BL21(DE3)化学感受态细胞购自南京诺唯赞生物科技有限公司；P97R1单克隆抗体(MAb)2A10 由本实验室制备并保存[12]。40 只雌性BALB/c 小鼠，体质量18 g～22 g，购自扬州大学医学比较中心。

1.2 主要试剂 质粒快速小量抽提试剂盒购自北京全式金生物技术有限公司；DNA 回收试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；山羊抗兔HRP-IgG 购自武汉博士德生物公司；兔源抗CTB 抗体购自美国Bio-Rad 公司；牛血清白蛋白(BSA)购自Biosharp 生物科技有限公司；商品化CTB 购自Sigma 公司；GM1 购自百灵威科技有限公司；TMB 显色液和BCA 蛋白浓度测定试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司；山羊抗鼠HRP-IgG 购自武汉博士德生物工程有限公司；低分子蛋白Marker 购自Promega公司；His-Tag 亲合层析柱购自金斯瑞生物技术有限公司。

1.3 重组质粒pET-CTB-P97R1 的构建与鉴定根据GenBank 中Mhp P97 基因序列(U50901)设计引物扩增P97 基因R1 区，上下游引物P97R1-up：5'-A AAGCTAGCTTACCTCAGCCGCCAGCA-3' (NheⅠ)/P97R1-down： 5'-TTTCTCGAGAGCCATTGGGAAAT AGTCTT-3' (XhoⅠ)。以Mhp 168 株DNA 为模板，PCR 扩增P97 基因R1 重复区。PCR 反应条件：94 ℃10 min ；94 ℃60 s、54 ℃60 s、72 ℃ 30 s，30 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经1 %琼脂糖凝胶电泳检测。PCR 产物回收纯化后，用NheⅠ和XhoⅠ双酶切后克隆至pET-CTB-p277 载体，构建重组质粒pET-CTB-P97R1。PCR 检测后由金斯瑞生物技术有限公司测序鉴定。

1.4 重组蛋白(rCTB-P97R1)的表达、纯化及鉴定将pET-CTB-P97R1 转化大肠杆菌BL21，37 ℃振荡培养至OD600nm值为0.4～0.6，加入IPTG 至终浓度为1.0 mmol/L，37℃振荡培养4 h～6 h，离心收集菌体， 超声裂解后收集沉淀和上清， 利用SDS-PAGE 分析重组蛋白表达，同时对重组蛋白经亲和层析纯化，用15 % SDS-PAGE 分析纯度。以P97R1 MAb 2A10 为一抗(1 ∶2 000 倍)，山羊抗鼠HRP-IgG 为二抗(1∶10 000 倍)，western blot 鉴定重组蛋白。

1.5 rCTB-P97R1 与GM1 结合能力的检测 参照文献[13]GM1-ELISA 方法，用GM1 (5 μg/mL)包被过夜后与不同浓度的CTB-P97R1 (从5 μg/mL 开始，2 倍倍比稀释，直至CTB-P97R1 浓度为0.005 μg/mL)孵育，以兔抗CTB 抗体(1∶4 000 倍)为一抗，山羊抗兔HRP-IgG (1∶8 000 倍)为二抗，检测CTB-P97R1 与GM1 的结合能力，同时使用相同浓度的商品化CTB蛋白作为对照进行对比试验。同时将各重组蛋白与商品化CTB 蛋白均于100 ℃水浴处理5 min 后检测其与GM1 的结合能力。

1.6 动物分组及免疫 选取BALB/c 小鼠随机分成4 组，每组10 只，分别设为rCTB-P97R1+猪支原体肺炎(168 株)活疫苗免疫组(免疫0.3 mg rCTB-P97R1+107CCU 活疫苗)，rCTB-P97R1 对照组(免疫0.3 mg rCTB-P97R1)，猪支原体肺炎(168 株)活疫苗对照组(免疫107CCU 活疫苗)和阴性对照组，每只小鼠滴鼻免疫50 μL，2 周后以相同方式加强免疫1 次。

1.7 小鼠IgG 抗体及sIgA 抗体的检测 在二次免疫后7 d、14 d、21 d 和28 d 分别对小鼠进行眼框采血，分离血清，-20 ℃保存，用于检测血清中Mhp、P97R1 的IgG 抗体水平[12,14]；在二次免疫后7 d迫杀小鼠，气管插管注入1 mL PBS，轻轻揉捏胸腔后回抽液体，收集支气管肺泡灌洗液(BALF)，-20 ℃保存，用于检测BALF 中Mhp、P97R1 的sIgA 抗体水平[15]。

1.8 数据分析 所得数据均采用SPSS 软件进行统计学分析。

2 结 果

2.1 pET28a-CTB-P97R1 的构建与鉴定 以Mhp 168 株DNA 为模板，P97R1-up/P97R1-down 为引物，PCR 扩增其P97 基因的R1 区片段P97R1，将该基因片段克隆至pET-CTB-p277 中，构建重组质粒pET- CTB-P97R1。对构建的pET-CTB-P97R1 进行PCR 鉴定，结果显示PCR 扩增出约300 bp 的基因片段，与预期一致(图1)。重组质粒序列测定结果显示，其基因序列与设计的CTB-P97R1 基因片段完全一致，表明正确构建了重组质粒pET-CTB-P97R1。

图1 重组质粒pET-CTB-P97R1 的PCR 鉴定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pET-CTB-P97R1 by PCR

2.2 rCTB-P97R1 的表达及纯化 pET-CTB-P97R1/BL21 重组菌液经IPTG 诱导表达，SDS-PAGE 检测结果显示在21.5 ku 处出现目的蛋白条带(图2)，且rCTB-P97R1 存在于裂解上清中，用His-Tag 亲合层析柱纯化重组蛋白，经western blot 鉴定结果显示，在21.5 ku 处出现目的条带，与SDS-PAGE 中纯化蛋白的位置一致，表明rCTB-P97R1 得到了表达，且具有较好的反应原性。

2.3 rCTB-P97R1 与GM1 结合能力的测定 通过GM1-ELISA 方法检测rCTB-P97R1 与GM1 的结合能力。结果显示，rCTB-P97R1 可以与GM1 结合，且随着rCTB-P97R1 浓度的降低，其与GM1 结合能力下降，具有剂量依赖性。而不同浓度的rCTB-P97R1经过加热处理后，其与GM1 结合能力均丧失。商品化CTB 与GM1 的结合能力也随浓度降低而下降，且热处理后不同浓度的CTB 与GM1 结合能力也均丧失。本实验制备的rCTB-P97R1 的GM1 结合能力与商品化CTB 结合GM1 的能力相当(图3)。表明rCTB-P97R1 较好地保持了天然CTB 的体外生物活性。

图2 rCTB-P97R1 重组蛋白的表达纯化和western blot 鉴定Fig.2 The detection of the rCTB-P97R1 expression, purification by SDS-PAGE and identification of the rCTB-P97R1 by western blot

图3 rCTB-P97R1 与GM1 结合能力的检测Fig.3 GM1-binding ability of rCTB-P97R1

2.4 免疫后小鼠血清IgG 抗体水平的检测 于二次免疫后7 d、14 d 、21 d、28 d 采血分离血清进行抗体检测。结果显示阴性对照组和rCTB-P97R1 免疫组小鼠均不能产生Mhp 全菌蛋白抗体。活疫苗对照组能够产生较强的Mhp 全菌蛋白抗体，而rCTB-P97R1+ 活疫苗免疫组小鼠该抗体水平更高，在二次免疫后7 d、14 d 、21 d 与活疫苗对照组相比差异极显著(p＜0.01)，在二次免疫后28 d 差异显著(p＜0.05)(图4A)。表明rCTB-P97R1 对猪支原体肺炎活疫苗的免疫刺激能力有显著的增强作用。

通过检测小鼠血清中的P97R1 抗体水平结果显示，活疫苗对照组不能有效诱导小鼠产生针对P97R1 抗原的抗体，与阴性对照组无差异。rCTBP97R1+ 活疫苗免疫组和rCTB-P97R1 组均能够诱导小鼠产生较强的P97R1 抗体，且该两组诱导小鼠产生的P97R1 抗体水平无显著差异(p＞0.05)，但其与活疫苗对照组相比均差异极显著(p＜0.01)(图4B)，结果表明rCTB-P97R1 能够诱导小鼠对P97R1 抗原的体液免疫应答。

图4 免疫小鼠血清中IgG 抗体检测Fig.4 Detection of IgG antibody in mice serum after immunization

2.5 免疫后小鼠BALF 中sIgA 抗体水平的检测通过检测二次免疫后7 d 的BALF 中sIgA 抗体，结果显示rCTB-P97R1+活疫苗免疫组诱导小鼠产生抗Mhp 全菌蛋白的sIgA 抗体，与活疫苗对照组相比差异显著(p＜0.05)，但其针对P97R1 的sIgA 抗体与其它组相比升高不显著(p＞0.05)(图5)。表明重组蛋白rCTB-P97R1 与活疫苗联合使用能够显著增强小鼠针对全菌蛋白抗原的黏膜免疫反应。

图5 小鼠免疫7 d 后BALF 中sIgA 抗体检测Fig.5 Detection of sIgA antibody in BALF of the mice 7 days after second immunization

3 讨 论

黏膜是机体免疫防御的第一道防线，在防御细菌、病毒等病原体引起的呼吸道及肠道感染中起主要作用。黏膜免疫与自然感染最接近，是呼吸道疾病免疫预防的理想途径。但由于黏膜表面特殊的理化性质，减弱了黏膜免疫应答的强度，甚至常常导致免疫耐受。良好的黏膜免疫佐剂能够帮助疫苗提高黏膜免疫能力，使少量的抗原即可诱导机体产生早期、高效且持久的免疫应答。CTB 是较为常用的黏膜免疫佐剂之一，其具有很强的增强黏膜局部及系统免疫应答的能力且去除了A 亚基保证了良好的安全性[4]。CTB 在黏膜免疫中的机制主要包括促进抗原通过黏膜屏障，加强抗原被树突状细胞(DC)和其它抗原提呈细胞(APC)的提呈作用，增强抑制性T 细胞分泌TGF-β1[16]。CTB 可以与抗原偶联、融合或直接与抗原混合，有效发挥佐剂作用[17-18]。

Mhp 致病的先决条件是其对猪呼吸道支气管上皮细胞的特异性黏附，因此有效诱导对重要黏附因子的免疫应答具有重要意义。P97 蛋白是参与Mhp黏附猪支气管上皮细胞的主要因子。研究表明，P97 蛋白的主要功能域位于C 端，其中R1 区是直接参与黏附的区域，也是主要的抗原决定簇。已有多个研究室以P97 或其R1 重复区为抗原尝试重组疫苗的研究[19-20]。

本研究采用基因工程技术将CTB 与P97R1 区基因串联经诱导表达了重组融合蛋白rCTB-P97R1，经GM1-ELISA 方法检测，显示rCTB-P97R1 与GM1 的结合能力与商品化的CTB 相当，表明偶联于C 端的P97R1 分子并未影响CTB 的构象，重组蛋白很好地保持了天然CTB 分子的佐剂活性。将CTB-P97R1与Mhp 168 活疫苗混合滴鼻免疫后，显著提高了小鼠血清中的全菌蛋白IgG 抗体水平及BALF 中的sIgA 抗体水平，表明rCTB- P97R1 很好地发挥了黏膜佐剂作用，显著提升了小鼠呼吸道局部粘膜免疫应答。同时，血清中针对Mhp P97R1 的IgG 抗体也显著升高，表明rCTB- P97R1 蛋白还可以强化对Mhp 重要抗原P97R1 的免疫应答水平，更有利于对疾病的防御。

值得注意的是BALF 中针对P97R1 的sIgA 抗体并不明显，可能与P97R1 剂量低有一定关系，提示单独使用rCTB-P97R1 作为重组疫苗滴鼻免疫小鼠其免疫效果可能较有限，不一定能够产生有效免疫保护。目前对Mhp 的重组疫苗也有报道，但能够提供有效保护的重组疫苗并不多。与病毒不同，细菌的抗原成分非常复杂，对于细菌性疫苗而言重组疫苗的研制更加困难，仅依靠一种或少数抗原免疫往往效果不佳[21-22]。目前，基于完整细菌的活疫苗或灭活疫苗仍是细菌疫苗研制的主要方向，而向这类疫苗中补充关键的保护性抗原或许成为提升疫苗效果的途径之一。对于Mhp 重组疫苗而言，还需要更多的研究筛选鉴定其保护性抗原，并进行合理的优化组合，并配合佐剂研究才有可能获得免疫效果较为满意的疫苗。

综上所述，本研究构建、表达、纯化了重组蛋白rCTB-P97R1，利用小鼠动物模型验证了其可以显著增强猪支原体肺炎活疫苗的滴鼻免疫效力，同时可提升小鼠对P97R1 关键抗原的免疫应答。小鼠免疫试验数据可为后续的本动物免疫效力试验提供参考，同时为后期开发经滴鼻途径免疫的猪支原体肺炎活疫苗提供了数据支持。