景天三七总黄酮的纯化、 自由基清除活性及初步鉴定

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(1.西南科技大学生命科学与工程学院,四川绵阳 621010; 2.四川省生物质资源利用与改性工程技术研究中心,四川绵阳 621010)

景天三七(SedumaizoonL.),景天科植物又被称为高钙菜、救心菜、土三七等[1],四川、浙江、陕西、甘肃、山西、宁夏、湖北、青海等地均有种植[2]。景天三七营养丰富,有研究表明,景天三七具有降低血管硬化、促进新陈代谢、抗氧化及解毒消肿等[3-5]作用,是有一定药食潜力的资源。景天三七具有种植范围广,环境适应性强,且采收期长等优点,可以为功能性提取物的生产加工提供稳定的原料来源。近年来,黄酮类化合物的研究在食品领域趋于热门,加快了对具有良好功能性的药食同源的植物资源的开发,付煜荣等[6]采用颜色反应检识证明景天三七中含有黄酮类化合物。张兴桃等[7]通过超临界CO2萃取景天三七总黄酮。

目前,对景天三七功能性成分的研究与开发主要集中在黄酮类、生物碱、甾醇[8-11]等活性成分。黄酮类化合物具有抗氧化性、抗炎症、抗病毒、抗菌[12-13]等功效,并对防治癌症、肿瘤、心血管[14-16]等疾病具有重要意义。而关于景天三七中的黄酮类化合物纯化及性质研究较少。本研究基于文献报道[17-19],选用大孔树脂静态吸附方法纯化景天三七总黄酮,并研究了景天三七总黄酮最佳纯化工艺及其性质,为景天三七中黄酮类化合物的系统性研究做出一定的补充。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

景天三七 均于2017年8月采自西南科技大学蔬菜实验园,新鲜,无虫害,并由统一干燥方法加工制样;芦丁对照品 南京替斯艾么中药研究所 标准品;二苯代苦味肼基自由基(DPPH)、ABTS SIGMA ALDRICH 公司,分析纯,抗氧化剂;乙醇、盐酸、三氯乙酸、铁氰化钾、四硼酸钠、硝酸铝、抗坏血酸、镁粉、锌粉 成都市科龙化工试剂厂,分析纯;D-101、AB-8、X-5、DA-201型大孔树脂 成都市科龙化工试剂厂。

U-3900H型紫外分光光度计 Hitachi日立公司;Agilent1200系列LC-MS 安捷伦公司;pH 510酸度计 EUTECH INSTRUMENTS公司;FD-T12N-80型冷冻真空干燥仪 Thermo Electron Corporation;DJ灵巧型中药粉碎机 海淀久中药机械制造有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 景天三七总黄酮粗提物样品液的制备 景天三七烫漂30 s后55 ℃烘干,置入中药粉碎机粉碎,粉末过40目筛,取100 g粉碎后的景天三七经由乙醇浸提(81 ℃,90%乙醇,料液比1∶44,浸提3 h),采用旋转蒸发除醇后加入等体积石油醚萃取除杂,再次旋转蒸发除去石油醚,加入95%乙醇溶解,低温静置12 h后经离心(4500 r/min,15 min)取上清液,浓缩除醇,进行预冻过夜(0 ℃)后置于真空冷冻干燥机中干燥36 h得景天三七总黄酮粉末。精确称取0.1000 g总黄酮粉末,用30%乙醇微热溶解后,用同浓度乙醇定容到100 mL,得1.00 mg·mL-1景天三七总黄酮粗提物样品液,测定总黄酮实际含量,备用。

1.2.2 大孔树脂的预处理 预处理过程为:将各树脂用95%乙醇浸泡24 h后依次用乙醇、去离子水冲洗,至洗尽醇味;用5%盐酸溶液处理,用去离子水洗至中性;最后用5%NaOH溶液处理,用去离子水洗至中性,保存备用。

1.2.3 总黄酮含量测定 以芦丁标准品为对照,采用NaNO2-Al(NO3)3法[20]测定黄酮含量;进行芦丁标准曲线的绘制和回归方程的建立,根据标准曲线计算所得回归方程为y=1.1688x+0.0054,决定系数R2=0.9998,具有良好线性关系,x为芦丁标准液浓度(mg·mL-1)。

样品的测定:准确量取景天三七总黄酮粗提物样品液1 mL。按上述方法测定吸光度,并带入标准曲线方程计算,得出总黄酮含量。

1.2.4 大孔树脂静态吸附-解吸附实验

1.2.4.1 大孔树脂筛选 将预处理好的四种大孔树脂(D101型、DA-201型、X-5型、AB-8型)抽滤并经滤纸吸干后,各精确称取1.0 g于200 mL锥形瓶中,再准确加入一定浓度的景天三七总黄酮样品液25 mL。于30 ℃、振荡频率100 r/min的条件下振荡吸附24 h后,测定平衡液总黄酮浓度Ce。分别抽滤后,将大孔树脂移回锥形瓶中,准确加入25 mL 95%乙醇,再在30 ℃、振荡频率100 r/min的条件下振荡静态解吸附24 h后,测定解吸液总黄酮浓度Cd。通过比较吸附率、解吸率和回收率,筛选出理想型大孔吸附树脂。

1.2.4.2 大孔树脂静态吸附-解吸附动力学曲线 树脂静态吸附曲线:精确称取筛选出的大孔吸附树脂1.00 g于200 mL三角锥形瓶中,加入25.00 mL浓度为0.7 mg·mL-1的景天三七总黄酮纯化液。在pH为4.0、30 ℃、振荡频率100 r/min的条件下振荡静态吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液测定总黄酮浓度计算吸附率,建立吸附率与时间的静态吸附动力曲线。

树脂静态解吸附曲线:将上述已经吸附饱和的大孔吸附树脂抽滤并用滤纸吸干后转移到200 mL三角锥形瓶中,加入95%乙醇25 mL,在pH为4.0、30 ℃、振荡频率100 r/min的条件下振荡静态解吸附7 h,每隔30 min取0.2 mL上清液测定总黄酮浓度并计算解吸率,建立解吸率与时间的静态解吸附动力学曲线。

1.2.4.3 大孔树脂静态吸附及解吸附条件优化 使用筛选出的DA-201依照方法1.2.4.1及1.2.4.2进行静态吸附和静态解吸附实验,研究树脂静态吸附和解吸附动力学,考察样液质量浓度(0.1、0.3、0.7、1.4、2.8 mg/mL,pH为4.0)和pH(2、3、4、5、6,样液质量浓度为0.7 mg/mL)对静态吸附的影响,乙醇浓度(75%、80%、85%、90%、95%,pH为4.0,样液质量浓度为0.7 mg/mL)对静态解吸附的影响。实验均重复三次取平均值。

1.2.4.4 树脂吸附率及解吸率的计算 吸附量(Q)、吸附率(E)、解吸率(D)、回收率(R)分别按照如下公式计算[21]。

式(1)

式(2)

式(3)

式(4)

式中:C0-溶液总黄酮起始浓度,mg·mL-1;Ce-溶液平衡时黄酮浓度,mg·mL-1;V0-吸附液体积,mL;m-树脂质量,g;Cd-解吸液黄酮浓度,mg·mL-1;Vd-解吸液体积,mL。

1.2.5 景天三七总黄酮抗氧化活性测定

1.2.5.1 景天三七精提液样品的制备 按1.2.4优化试验得到的DA-201型树脂纯化分离条件处理景天三七总黄酮样品液,收集洗脱液,离心(4500 r/min,15 min,25 ℃),浓缩除醇,进行预冻过夜(0 ℃)后置于真空冷冻干燥机中干燥36 h得景天三七精提物总黄酮粉末。按照方法1.2.1配制成景天三七精提物溶液,比较纯化前后的黄酮纯度和抗氧化活性。

1.2.5.2 总黄酮纯度的测定 总黄酮溶液理论浓度值为1.00 mg·mL-1(P2),测定粗提物及精提物液样品纯度(P1),计算含量。按式(5)计算含量(P)。

式(5)

式中:P1-溶液实际浓度,mg·mL-1;P2-溶液理论浓度,mg·mL-1。

1.2.5.3 DPPH·清除作用测定 参考Helal等[22]对DPPH·清除率测定方法,于517 nm下测定吸光值,按下式(6)计算DPPH·清除率(K)。以VC作为阳性对照。

式(6)

式中:Ai-加入样品溶液吸光值;Aj-样品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.4 ABTS+·清除活性 以过硫酸钾溶液配制ABTS+储备液,并以磷酸盐缓冲液稀释得到ABTS+·测定液,参照Binsan等[23]的方法,按下式(7)计算ABTS+·自由基清除率。以VC作为阳性对照。

式(7)

式中:Ai-加入样品溶液吸光值;Aj-样品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.5.5 对羟基自由基清除作用测定 参照薛丁萍等[24]对羟自由基的测定方法,按下式(8)计算羟自由基清除率(R)。以VC作为阳性对照。

式(8)

式中:Ai-加入样品溶液吸光值;Aj-样品溶液本底吸光值;Ac-空白吸光值。

1.2.6 景天三七总黄酮纯化物初步鉴定

1.2.6.1 紫外-可见光谱扫描 用紫外可见分光光度计,于250～600 nm波长范围内对景天三七总黄酮纯化液进行紫外-可见光谱扫描分析。

1.2.6.2 红外光谱扫描 取适量景天三七总黄酮纯化物粉末,与适量的溴化钾研磨混合后压片,在400～4000 cm-1范围内进行红外光谱扫描。

1.2.6.3 颜色反应 采用盐酸-锌粉反应、四氢硼钠反应、铝盐反应、镁盐反应、与浓硫酸反应[25],观察并记录颜色,对景天三七总黄酮的种类进行初步鉴定。

1.2.6.4 HPLC-MS分析 供试品溶液制备:取景天三七精提物总黄酮粉末0.1 g,置50 mL容量瓶中,加入70%乙醇40 mL,超声处理30 min,放至室温,用70%乙醇定容。摇匀后取适量离心5 min(12000 r/min),取上清液,即得。

色谱条件:色谱柱为ZorbaxEclipseXDB-C18(4.6×250 mm,5 μm);柱温40 ℃;进样量50 μL;检测波长270 nm;流速0.63 mL/min。流动相A:水;流动相B:甲醇。洗脱程序:0 min,0 A;5 min,20% A;10 min,40% A;15 min,80% A;20 min,95% A。质谱条件:采用ESI源,负离子模式,离子扫描范围0～1000 m/z;雾化气压力:207 kPa;干燥气流速:10 L/min;干燥气温度:325 ℃;TrapICC:30,000 units;最大累计时间:300 ms;MS诱导碰撞能量为1.0 V。

1.3 数据处理

实验均平行重复3次,采用Excel,SPSS 23软件进行数据统计分析,使用Origin 8.5处理数据和绘图;红外、紫外、色谱图、质谱图由仪器自带系统给出。

2 结果与分析

2.1 大孔树脂对景天三七总黄酮静态吸附解吸优化

2.1.1 大孔树脂筛选 在相同静态吸附试验条件下,测得各树脂对景天三七总黄酮的静态吸附-解吸附结果如表1所示。

表1 不同大孔吸附树脂对景天三七总黄酮静态吸附和解吸结果Table 1 Static adsorption and desorption of total flavonoids from different macroporous

通常对大孔树脂吸附作用影响较大的因素有极性、树脂孔径、比表面积等。由表1可知,所选取的4种大孔树脂对景天三七总黄酮均有一定的吸附量,且相互之间差异性显著(p<0.05),DA-201的吸附量、吸附率、解吸率、回收率均高于其它类型树脂。推测所选树脂的极性和目标物极性越相近,DA-201属于极性共聚体,与黄酮类化合物极性相似,因此其具有较强的吸附能力。虽然X-5和AB-8型树脂孔径和比表面积大更有利于解吸过程,但可能因其极性原因,其吸附率较DA-201型低。综合各方面因素,最终选用DA-201型大孔树脂作进一步研究。

2.1.2 大孔树脂静态吸附-解吸附动力学曲线 由图1、图2可知,DA-201型大孔树脂的吸附率和解吸率在对景天三七总黄酮的吸附-解吸附的过程中,随时间的增加而分别相应增长,吸附率在1 h后维持在相对平稳的状态,解吸附率在3 h后趋于平稳,所以从实际生产的角度考虑,1 h为最适宜吸附时间,3 h为最适宜的解吸附时间。

图1 DA-201树脂静态吸附动力学曲线Fig.1 Static adsorption kinetic curve of DA-201 resin

图2 DA-201树脂静态解吸附动力学曲线Fig.2 Static desorption kinetic curve of DA-201 resin

2.1.3 样液质量浓度对DA-201树脂吸附率的影响 由图3可知,DA-201树脂吸附率随样液质量浓度的升高不断提升,但在样液质量浓度增加至0.7 mg/mL后,上升趋势近于平稳。在样液浓度较低时,样液中的黄酮分子和DA-201树脂的接触几率较小,所以吸附率低;当样液质量浓度持续增加后,DA-201树脂的孔径已经处于填充饱和状态,继续提升样液质量浓度对其吸附率起不到提升作用。考虑吸附效率,所以样液质量浓度选用0.7 mg/mL为宜。

图3 样液质量浓度对DA-201树脂吸附率的影响Fig.3 Effect of mass concentration of liquid sample on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.4 样液pH对DA-201树脂吸附率的影响 由图4可知,随样液pH的升高,DA-201树脂吸附率逐渐降低,在pH为2～3时吸附率呈缓慢下降趋势。依据大孔树脂的吸附原理,样液pH应当接近吸附目标物的酸碱度时,吸附效果最好,但pH过低时易对黄酮类化合物产生破坏作用,导致分解变性等。因此虽然黄酮类化合物多为酸性或弱酸性的酚类物质,但实际采用pH=3为最佳条件。

图4 样液pH对DA-201树脂吸附率的影响Fig.4 Effect of sample solution pH on adsorption rate of DA-201 resin

2.1.5 乙醇浓度对树脂静态解吸附的影响 由图5可知,当乙醇浓度为90%时,景天三七总黄酮的解吸率达到最高。因为黄酮类化合物多易溶于乙醇,乙醇浓度越高,黄酮类物质溶解程度越高,但由于有解吸液中其余醇溶性杂质的存在,当乙醇浓度过高会导致其杂质解吸增多,降低黄酮类化合物的吸附率。故乙醇浓度选择90%为宜。

图5 乙醇浓度对DA-201树脂解吸率的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the desorption rate of DA-201 resin

2.2 景天三七总黄酮纯化前后的抗氧化活性

对景天三七总黄酮经DA-201型大孔树脂纯化前后的总黄酮纯度进行对比,并通过IC50(50%清除率)作为评价标准对ABTS清除率、羟自由基、DPPH清除率三个指标进行纯化前后的体外抗氧化能力对比分析。IC50值可通过SPSS 23软件对图6中的清除率曲线进行回归分析拟合处理,结果见表2。由表2可知,经DA-201型大孔树脂纯化后,总黄酮的纯度由19.38%提高到43.78%,景天三七总黄酮纯度提升了2.26倍,且羟自由基、DPPH清除率的IC50均低于纯化前,IC50值越低,说明样品抗氧化性越强。单方方等人[26]在对牡丹叶的黄酮类化合物纯化对抗氧化能力影响研究时,同样发现黄酮纯度越高抗氧化效果越明显。所以DA-201型大孔树脂对景天三七总黄酮纯化效果整体突出,较大程度上提升了景天三七总黄酮的纯度和体外抗氧化活性,可以为下一步的景天三七总黄酮性质研究提供适宜样品。

表2 纯化前后景天三七总黄酮纯度、体外抗氧化能力比较Table 2 Comparison of purity and antioxidant capacity of total flavones of Sedum aizoon before and after purification

图6 景天三七总黄酮体外抗氧化作用Fig.6 Antioxidant activity of total flavonoids from Sedum aizoon in vitro注:(a)～(c)分别为ABTS自由基清除率、 羟自由基清除率和DPPH自由基清除率。

2.3 景天三七总黄酮性质初步鉴定

2.3.1 紫外可见吸收光谱分析 通常大多数黄酮类化合物的紫外可见吸收光谱由峰带I(300～350 nm,产生于黄酮类化合物基本结构中的环苯甲酰系统)和峰带II(350～400 nm,产生于黄酮类化合物基本结构中的环肉桂酰系统)两部分组成。)对样品溶液在250～600 nm波长范围内进行紫外-可见光谱扫描。结果如图7所示,景天三七总黄酮的吸收波长主要分为两个吸收带,峰带I的吸收峰在350～390 nm间,峰带II的吸收峰位于270 nm,符合黄酮醇类化合物吸收峰带的特征,峰带II的吸收峰强度明显强于峰带I,并且峰带I峰型较宽、平缓,可能是因为环苯甲酰系统上取代基成分种类较多。

图7 景天三七总黄酮的紫外-可见吸收光谱图Fig.7 UV Vis absorption spectra of total flavonoids from Sedum aizoon

2.3.2 红外可见吸收光谱分析 由图8可知,费总黄酮样品和芦丁在400～4000 cm-1范围内出现多处波峰。其中,标准品芦丁在3427 cm-1和样品在3432 cm-1处的宽大且强度极高的吸收峰均为游离O-H伸缩振动的吸收峰,说明了酚羟基的存在;芦丁标准品的2935 cm-1和样品的2920 cm-1,为-CH2的反对称伸缩振动峰[27];在1650～1450 cm-1区,是芦丁的苯环骨架震动特征吸收峰分布区域,此处景天三七总黄酮样品和芦丁一致具有三个吸收峰,可推测样品可能有苯环的存在;在1500～1300-1cm-1处,芦丁和样品都出现一定特征峰,这是O-H的面内弯曲振动峰;C-O的伸缩振动吸收峰位是1300～1200 cm-1,芦丁和样品在此区域都有相应的特征峰;芦丁和样品位于573 cm-1处的吸收峰是苯环上的取代基引起的,样品此处的吸收峰强度低于芦丁标准品,表明羟基取代位置不同[28]。依据上述基于吸收谱带的位置及对官能团推测的信息,景天三七总黄酮与芦丁的红外光谱有多处相似,初步判断景天三七总黄酮可能为黄酮醇,但具体的结构还需要进一步的研究与探索。

图8 景天三七总黄酮和标准品芦丁的红外光谱图Fig.8 Infrared spectrum of total flavones and standard Rutin of Sedum aizoon

2.3.3 颜色反应鉴定分析 对纯化后的景天三七总黄酮进行颜色反应,结果见表3。通过颜色反应结果,结合文献[29]报道,对景天三七总黄酮的性质进行进一步鉴定分析,初步推测为黄酮醇类化合物。

表3 景天三七总黄酮颜色反应结果及分析Table 3 Results and analysis of the color reaction of the total flavonoids of Sedum aizoon

此结果也与紫外-可见光谱扫描和红外光谱扫描的结果一致。

2.3.4 HPLC-MS信息分析 由于纯化后的样品是仍含有一部分杂质的混合物,且成分复杂未知,对质谱信息造成一定的干扰,本研究决定采用低分辨质谱仪对纯化后的样品进行初步的物质推测,以期为后续景天三七黄酮类化合物分级分离定性研究作一定参考。

如图9总离子流图,各峰分离效果较好,对其中主要的6个峰的质谱信息进行推断,依据特征碎片离子峰的质荷比结合文献报道的黄酮类化合物信息[30-31],从而可以初步推测样品中可能含有的黄酮化合物,结果如表4所示,可能主要存在的黄酮类化合物有芸香糖苷、水飞蓟素类、芦丁类、金丝桃苷类、山奈酚-3-O-糖苷类、槲皮素-3-O-糖苷类。

图9 景天三七纯化后总黄酮样品负总离子流色谱图Fig.9 Total negative ion chromatograms of total flavonoids after purification

图10 代表化合物的质谱图Fig.10 Mass spectrum of the represents compound 注:图(a)～(f)分别为1～6代表化合物一级质谱图。

表4 代表化合物质谱数据Table 4 Mass spectrometry data representative compound

3 结论

通过静态吸附解吸附实验,筛选出DA-201型大孔吸附树脂为最佳树脂类型,且获得DA-201型大孔吸附树脂最佳静态吸附分离工艺参数为:吸附时间3 h,样液质量浓度为0.7 mg/mL,上样液pH为3.0,解吸附乙醇浓度为90%。在该条件下静态吸附率为81.05%,解吸附率为86.05%。纯化后,总黄酮的纯度由19.38%提高到43.78%,其羟自由基、DPPH清除率的IC50分别由69.47、44.02 μg/mL下降到43.25、30.16 μg/mL,纯化后的纯度和抗氧化能力明显提升。通过紫外可见光谱、红外光谱、颜色反应等一系列性质鉴定分析方法,初步推测本文所研究的纯化后的景天三七总黄酮中可能含有芸香糖苷、水飞蓟素类、芦丁、金丝桃苷类、山奈酚-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-糖苷类等化合物,具体的成分组成及结构分析有待进一步研究。