葛根素激活SIRT3/SOD2信号通路缓解多柔比星心脏毒性实验研究*

马 超，郭万刚，马文帅

空军军医大学唐都医院心血管内科(西安 710038)

多柔比星(Doxorubicin，DOX)是蒽环类抗肿瘤药物的成员之一，具有强效抗肿瘤作用。它广泛用于治疗乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肉瘤和其他类型的癌症[1-2]。多柔比星最主要的副作用是心脏毒性，多柔比星累积剂量为550 mg/m2时心脏毒性发生率为7%，累积剂量为700 mg/m2时发生率为18%[3]。充分证据显示，多柔比星可明显增加心肌细胞自由基产量，损害细胞抗氧化酶活性，进而引起细胞损伤[4]。

葛根素(8-β-D-葡萄吡喃糖-4',7-二羟基异黄酮)，是从葛根中提取的一种糖苷化合物[5]。它是一种在中国、日本、韩国和东南亚等国家和地区广泛用于治疗心绞痛、心肌梗死和其他心脏症状的传统中草药[6]。以前的研究表明，葛根素可以增加冠状动脉血流量，降低心肌耗氧量并可以减轻心血管疾病患者和动物的心肌缺血再灌注损伤[7]。然而，关于葛根素对多柔比星引起的心脏毒性的研究很少且机制尚未完全阐明。

以往研究证实，葛根素具有强烈的抗氧化活性，并可通过抑制氧化应激损伤缓解肾损伤[8]、肝损伤[9]、心肌缺血再灌注损伤[10]等多种疾病。此外，最新研究表明，葛根素具有潜在的抗凋亡作用[11]。因此，我们假设葛根素可通过减少心肌细胞凋亡和(或)氧化应激损伤来缓解多柔比星引起的急性心肌损伤。此外，葛根素发挥心肌保护作用的具体分子信号机制也需进一步探究。

材料和方法

1 主要试剂和实验动物 葛根素(Sigma公司)；DOX(Cayman公司)；抗β-actin抗体(CST公司)；抗SIRT3、Ac-SOD2抗体(Abcam公司)；抗SOD2抗体(Santa-Cruz公司)；羊抗兔、羊抗鼠二抗(北京中杉金桥公司)；DHE染料(Invitrogen公司)；乳酸脱氢酶(LDH)和丙二醛(MDA)含量检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)。雄性C57小鼠，体重22～25 g，8周龄，由空军军医大学实验动物中心提供。

2 研究方法

2.1 动物模型的建立:如前所述[12]，单次腹腔注射多柔比星(15 mg/kg，溶于生理盐水)以诱导小鼠急性心脏毒性。对照组小鼠腹腔注射等容量生理盐水(0.2 ml)。

2.2 实验分组及给药方式:将90只C57BL/6小鼠随机分为六组，每组15只，即正常组(Control组)、单纯葛根素处理组(Pue组)、多柔比星处理组(DOX组)、多柔比星+葛根素处理组(DOX+Pue组)、3-TYP+多柔比星+葛根素(3-TYP+DOX+Pue)组；3-TYP+多柔比星(3-TYP+DOX)组。通过腹腔注射葛根素，给药剂量为10 mg/(kg·d)，给药5 d。SIRT3选择性抑制剂3-TYP(50 mg/kg，溶解于生理盐水)在多柔比星给药前3 d每日腹腔注射1次，共3次。

2.3 在体心脏血流动力检测:多柔比星处理5 d后，剔除小鼠颈前毛发。通过右颈总动脉插管检测等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(The maximum rate of upward pressure in the left ventricle，+dp/dt)和等容舒张期左心室压力下降的最大速率(The maximum rate of left ventricular pressure drop，-dp/dt)，具体操作方法参考以往文献[12]。

2.4 心肌组织凋亡检测和HE染色:多柔比星处理5 d后，取心脏，并将心脏置于10%福尔马林中固定24 h。制备石蜡块并切成5 μm的厚度；如以往文献所述方法[13]，用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP 缺口末端标记测定(TUNEL)试剂盒(Roche Molecular Biochemicals公司，德国)测量心肌细胞凋亡情况。细胞凋亡指数表示为凋亡细胞核数/计数的细胞核总数×100%。此外，将5 μm厚的心脏组织切片进行苏木精-伊红(HE)染色以观察心脏病理改变。

2.5 心肌组织蛋白表达测定:多柔比星处理5 d后，腹腔注射氯胺酮(85 mg/kg)和木聚糖(12.5 mg/kg)，再将实验动物安乐死。打开胸腔，取出心脏。用生理盐水洗涤心脏以除去残留的血液，将心脏组织用液氮冷冻，随后在-80 ℃冰箱中储存。将冷冻的组织解冻并使用匀浆器在PBS缓冲液(pH 7.4)中匀浆。将上清液分成2～3份，置于分开的管中，并再次储存在-80 ℃。用BCA蛋白定量试剂盒检测各组样品蛋白浓度。用10%Bis/Tris凝胶分离各组样本蛋白，并用湿转法将蛋白转移到PVDF膜上。用5%脱脂牛奶封闭1 h，室温下孵育抗SIRT3(1∶1000)、Ac-SOD2(1∶1000)、SOD2(1∶500)和β-actin(1∶1000)抗体2 h；TBST洗涤3次；室温孵育羊抗兔、羊抗鼠二抗(1∶5000)2 h；用TBST洗涤3次。使用BioRad成像系统检测条带并进行蛋白半定量分析。

2.6 心肌组织氧化应激水平测定:多柔比星处理5 d后，将液氮冰冻的心脏组织切成10 μm厚度的冰冻切片，按照试剂说明书进行DHE染色，荧光显微镜拍照并用Image Pro-Plus软件进行荧光强度分析。此外，将冰冻的心肌组织化冻后以心肌组织(g)和生理盐水(ml)1∶9的比例制作组织匀浆。按照MDA检测试剂盒说明书检测袭击组织内MDA含量。

结果

1 葛根素处理改善多柔比星引起的急性心脏毒性

心肌细胞空泡变性是DOX诱导的心脏毒性中心肌细胞损伤的重要标志。Control组小鼠心肌细胞几乎没有检测到空泡变性，而DOX处理组小鼠空泡变性明显增加。与DOX组相比，葛根素处理可以明显抑制小鼠心肌细胞空泡变性。与Control组相比，单纯给予葛根素不会引起心肌细胞发生空泡变性(图1A)。此外，我们使用LDH检测试剂盒通过反射光谱法检测了各组小鼠血清LDH活性。结果显示，与Control组小鼠相比，DOX组小鼠血清内LDH(心肌损伤的重要血清标志物)活性显著上升，而给予葛根素处理可以明显降低LDH活性(P<0.01，图1B)。小鼠多柔比星给药5 d后检测各组小鼠心脏收缩和舒张功能。如图1C-D所示，与Control组小鼠相比，DOX组小鼠心脏收缩和舒张功能明显受损，表现为+dp/dt与-dp/dt明显降低(P<0.01)。与DOX组相比，葛根素处理后能明显提高+dp/dt与-dp/dt(P< 0.01)。与Control小鼠相比，单纯给予葛根素对小鼠心脏收缩和舒张功能无明显影响(P>0.05)。综上所述，这些数据表明葛根素可有效缓解DOX诱导的急性心脏毒性。

2 葛根素处理抑制多柔比星引起的心肌氧化应激损伤 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后检测各组小鼠心肌组织内ROS产量。结果显示，与Control组小鼠相比，DOX组小鼠心肌组织内ROS产量明显增加，而葛根素处理可以明显降低ROS产量(P<0.01)。与Control组小鼠相比，单纯给予葛根素处理对心肌组织ROS产量无明显影响(P>0.05)。此外，DOX也可明显增加心肌组织内脂质过氧化产物MDA含量，而葛根素可以明显降低MDA含量(P<0.01)。与Control组小鼠相比，单纯给予葛根素对心肌组织MDA含量无明显影响(P>0.05,图1E-F)。

3 葛根素处理抑制多柔比星引起的心肌凋亡 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后检测各组小鼠心肌细胞凋亡情况。结果显示，与Control组小鼠相比，DOX组小鼠心肌细胞凋亡率明显增加，而葛根素处理可以明显降低心肌细胞凋亡率(P<0.01)。与Control组小鼠相比，单纯给予葛根素处理对心肌细胞凋亡率无明显影响(P>0.05,图1G-H)。

A：各组小鼠左室心肌HE染色图(400×)；B：血清乳酸脱氢酶(LDH)水平；C：等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(+dp/dt)；D：等容舒张期左心室压力下降的最大速率(-dp/dt)；E：活性氧(ROS)产量；F：丙二醛(MDA)含量；G：TUNEL染色(400×)，标尺为100 μm；H：凋亡率。**P< 0.01，与DOX组相比,△△P<0.01

图1 葛根素处理对多柔比星急性心脏毒性的影响(n=6)

4 葛根素处理可激活多柔比星处理后心肌组织内SIRT3/SOD2信号通路 小鼠腹腔注射多柔比星5 d后检测各组小鼠心肌组织内SIRT3/SOD2信号通路相关蛋白表达情况。我们发现，与Control小鼠相比，DOX组小鼠心肌组织中SIRT3的表达量明显下降，而Ac-SOD2的表达量明显增高(P<0.01)。与DOX组相比，葛根素处理可以明显提高心肌组织内SIRT3的表达，降低Ac-SOD2的表达(P<0.01)。与Control相比，单纯给予葛根素处理对SIRT3和Ac-SOD2蛋白表达水平无明显影响(图2，P>0.05)。

A：Western blot条带；B：SIRT3表达水平；C：SOD2乙酰化水平。与Control相比，**P<0.01;与DOX组相比,△△P<0.01

5 阻断SIRT3/SOD2信号通路逆转葛根素对多柔比星心脏毒性的保护作用 为了验证SIRT3/SOD2信号通路是否介导葛根素对多柔比星心脏毒性的保护作用，我们通过3-TYP特异性地抑制SIRT3的活性。与DOX+Pue组相比，3-TYP处理可以明显增加心肌细胞空泡变性程度，增加血清内LDH活性，恶化小鼠心脏收缩和舒张功能，增加心肌组织内ROS产量和MDA含量，增加心肌组织凋亡率(P均<0.05)。与DOX组相比，单纯给予3-TYP对DOX处理后心肌组织的上述指标无明显影响(P> 0.05)。见图3。

A：各组小鼠左室心肌HE染色图(400×)；B：血清乳酸脱氢酶(LDH)水平；C：等容收缩期左心室内压力上升的最大速率(+dp/dt)；D：等容舒张期左心室压力下降的最大速率(-dp/dt)；E：活性氧(ROS)产量；F：丙二醛(MDA)含量；G：TUNEL染色(400×)，标尺为100 μm；H：凋亡率。与DOX组相比，△/△△P<0.05/0.01，与DOX+Pue组相比,#/##P<0.05/0.01。

图3 抑制SIRT3/SOD2信号通路对葛根素心肌保护作用的影响(n=6)

讨论

多柔比星目前仍是临床上广泛使用的一种强效广谱化疗剂，可用于治疗多种癌症[1-2]。然而，许多副作用限制了它的临床疗效。心脏毒性是多柔比星的主要副作用，这种现象在临床患者和动物研究中均已被证实[3, 14]。探寻有效的心脏保护剂缓解多柔比星诱导的心脏毒性对于改善肿瘤患者预后有重要的临床意义。

葛根素是从葛根中提取的一种糖苷化合物[5]。充分研究证实，葛根素具有明显的心肌保护作用。李静等[15]证实，葛根素可以显著改善冠心病稳定型心绞痛患者临床症状和心电图表现，延缓动脉粥样硬化进程。行海舰[16]进一步发现，葛根素联合左卡尼汀可有效降低小儿病毒性心肌炎患者心肌酶水平，改善患者预后。Shao等[17]发现，葛根素对于脓毒症引起的心脏损伤也发挥了重要的保护作用，其作用的发挥与抑制炎症反应有关。Liu等[18]证实，葛根素可改善严重烧伤引起的心肌损害。此外，以往研究证实，葛根素能够改善多柔比星引起的心脏毒性[19]，但具体机制尚未完全阐明。值得注意的是，葛根素在多种疾病中都发挥了抗氧化应激和抗凋亡的作用。Wang等[20]证实，葛根素能够明显减轻创伤性脑损伤诱发的氧化应激损伤。Li等[21]发现，葛根素能够抑制糖尿病大鼠血管组织氧化应激损伤进而改善糖尿病引起的主动脉损伤。Zhou 等[8]证实，葛根素通过抑制氧化应激进而减轻内皮细胞凋亡，最终改善单侧输尿管梗阻引起的肾脏纤维化反应。在本研究中，我们发现，多柔比星处理后小鼠心肌组织内ROS产量和MDA含量明显增高，伴随心肌凋亡率明显上升。葛根素处理可以有效抑制多柔比星引起的氧化应激损伤和凋亡。综上，葛根素发挥抗多柔比星心脏毒性心肌保护作用与其抗氧化和抗凋亡活性密切相关。

Sirtuin是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的组蛋白去乙酰化酶家族，从细菌到人类均高度保守，共有SIRT1-7七个成员[22]。沉默信息调控因子3(Silent information regulator 3，SIRT3)是线粒体内最主要的去乙酰化酶，近些年来，越来越多证据显示，SIRT3是机体重要的内源性心肌保护分子。下调SIRT3表达可导致心肌细胞和成人心脏对缺血再灌注损伤的敏感性增加，并可能加剧老年心脏的心肌缺血再灌注损伤[23- 24]。Zhai等[25]发现，褪黑素可以通过激活SIRT3改善心肌缺血再灌注损伤。Guo等[26]证实，Angiotensin-(1-7)可以通过激活SIRT3逆转血管紧张素II引起的心肌肥厚。特别值得注意的是，最新证据显示，激活SIRT3可明显缓解由多柔比星引起的心脏毒性[27]。在本研究中，我们发现，多柔比星处理可以明显下调心肌组织中SIRT3的表达，进而上调SOD2的乙酰化水平。而葛根素处理可以明显上调SIRT3的表达，下调SOD2的乙酰化水平。值得注意的是，SIRT3也是机体内抵抗氧化应激损伤和凋亡的重要分子。研究发现，SIRT3是调节线粒体谷胱甘肽抗氧化防御系统的重要分子，可以延缓氧化应激引起的听觉丧失[28]。激活SIRT3能够减轻缺血再灌注引起的心肌细胞凋亡[25]。在本研究中，我们发现，抑制SIRT3信号通路可以明显减弱葛根素的心肌保护作用，具体体现在3-TYP处理可以明显增加多柔比星处理后心肌细胞空泡变性程度，增加血清内LDH活性，损害小鼠心脏收缩和舒张功能，增加心肌组织内ROS产量和MDA含量，增加心肌组织凋亡率。

综上所述，我们的研究首次证实葛根素处理能够明显改善多柔比星引起的心脏毒性，其具体作用机制为激活SIRT3/SOD2信号通路进而抑制氧化应激损伤和心肌凋亡。我们的研究为临床上应用葛根素治疗多柔比星心脏毒性提供了新的理论依据。