热量限制对Kkay小鼠氧化应激和血脂代谢的影响

陈 莉，赵健红，张霁雯

上海市宝山区罗店医院检验科(上海201908 )

近年来，随着生活水平和饮食结构的改变，老龄化及肥胖率的增加，糖尿病的患病人数快速增加，已成为严重的公共卫生问题。据调查显示，2015年世界成人患病率为8.8%[1]，而我国糖尿病患病率已经高达12.6%[2]。糖尿病发病机制尤为复杂，是由多基因遗传和环境因素引起的，一旦确诊，需终身治疗,同时糖尿病会诱发各种心脑血管疾病的发生[3]。环境因素中饮食结构的改变和体力活动减少而引起的肥胖在糖尿病的发病中起到重要作用，饮食控制对肥胖及糖尿病患者来说是最经济、最有效的控制手段之一[4]。饮食控制的主要是能量的限制，即热量限制(Calorie restriction，CR)。热量限制不仅可以预防多种迟发性疾病，延缓衰老，延长寿命[5]，而且在糖尿病等心血管疾病中发挥重要作用[6]。研究表明氧化应激是发生糖尿病等心血管疾病的主要机制之一，氧化应激是诱发糖尿病的发生因素之一[7]，而氧化应激与血脂异常在糖尿病微血管病变中也具有重要作用[8]。本研究利用糖尿病模型Kkay小鼠，探究热量限制对Kkay小鼠炎性因子和血脂代谢的影响，为热量限制控制糖尿病提供理论依据。

材料与方法

1 动物来源 从北京华阜康生物科技有限公司购买16只8周Kkay小鼠作为试验组，体重为35～45 g,另购买8周C57BL/6J小鼠8只，体重为25～35 g。维持12 h光照和12 h黑暗的昼夜节律。实验室温度: 20～25 ℃，湿度：(50±5)%，自由饮水。Kkay小鼠喂养kkay专用饲料(北京华阜康生物科技有限公司)，C57BL/6J喂养普通饲料，干预前适应性喂养1周，自由饮食。

2 实验仪器 血糖仪与血糖试纸购自美国罗氏公司；动物血清甘油三酯(TG)、胆固醇(TCH)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)及高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)血脂检测试剂盒购于南京建成生物工程研究有限公司；超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD) 、谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidase，GSH-Px) 试剂盒购于南京建成生物工程研究所有限公司。

3 动物分组与处理 将16只Kkay小鼠按照随机数字表的方法随机分为kkay对照组(kkay组，n=8只)，热量限制组(CR组，n=8只)；另外8只C57小鼠作为常规对照(C57组，n=8只)；kkay组与C57组小鼠给予自由饮食，每天记录下小鼠饮食摄入量，CR组饮食摄入量为kkay组小鼠摄入量的60%[7]，干预持续12周，每隔4周测各组小鼠的血糖、体重，于干预前，干预后第4周、8周及12周各测一组。

4 血清的采集与处理 各组大鼠干预12周后，大鼠腹腔注射麻药(2%戊巴比妥45 mg/kg),下腔静脉取血，3000 r/min离心10 min，取上清-20 ℃保存待用。血脂检测采用生化试剂盒，WST-1 法测定血清中SOD 活性; 过氧化物酶微量测定法检测血清中GSH-Px 的含量。

结果

1 热量限制对Kkay小鼠血糖的影响 干预前，两组Kkay小鼠血糖为(10.34±0.85) mmol/L，对照C57组小鼠血糖为(6.62±0.63) mmol/L，Kkay小鼠血糖与C57小鼠血糖差异具有统计学意义(P<0.001)；由表1发现C57组与kkay组干预前至干预第12周期间，血糖均趋于稳定，而对Kkay小鼠热量限制后，干预CR组血糖随着干预时间的延长，血糖逐渐下降，干预至第8周后，CR组Kkay小鼠血糖显著低干预水平(P=0.03)，同时较kkay组血糖仍显著下降(P<0.001)，趋于正常对照C57水平，但仍与C57血糖水平差异具有统计学意义(P<0.001)。

表1 热量限制对Kkay小鼠血糖的影响(mmol/L)

注：与C57组相比，*P<0.05；与kkay组相比，△P<0.05；各干预组中，与干预前相比，#P<0.05

2 热量限制对Kkay小鼠体重的影响 干预前两组Kkay小鼠体重为(39.87±4.62)g，显著高于正常对照C57组，差异具有统计学意义(P<0.001)；正常对照C57组小鼠和kkay组小鼠随着干预时间的增加，体重逐渐增加，而干预CR组体重较为稳定，并有略微下降，干预至第12周，CR组小鼠体重低于kkay组(P<0.001)。见表2。

表2 热量限制对Kkay小鼠体重的影响(g)

注：与C57组相比，*P<0.05；与kkay组相比，△P<0.05；各干预组中，与干预前相比，#P<0.05

3 热量限制对Kkay小鼠血脂代谢的影响 由表3可以看出，干预12周后，kkay组小鼠血清TCH、TG及LDL-C水平显著高于C57组，热量限制后，CR组血清TCH、TG及LDL-C水平显著降低(P<0.05)，其中血清TG水平降为正常对照C57组水平，TCH与LDL水平仍与正常对照C57组有一定的差异(P<0.05)；而kkay组小鼠血清HDL-C水平显著低于C57组，对Kkay小鼠给予热量限制后，其血清HDL-C与Kkay小鼠差异无统计学意义，仍低于C57组。

表3 热量限制对Kkay小鼠血脂代谢的影响(mmol/L)

注：*表示与C57组相比，P<0.05；△表示与kkay组相比，P<0.05

4 热量限制对Kkay小鼠氧化应激的影响 由表4可以看出，kkay组小鼠血清中SOD水平和GSH-Px水平显著低于C57组，而给予12周的热量限制后，CR组Kkay小鼠血清SOD和GSH-Px水平显著改善(P<0.05)，但仍与C57组小鼠血清炎性因子有一定的差异(P<0.05)。

表4 热量限制对Kkay小鼠氧化应激的影响

讨论

2型糖尿病是一组以胰岛素抵抗和胰岛素分泌减少的为特征，以高血糖为表现形式的慢性代谢性疾病[9]。糖尿病会诱发各种心脑血管疾病的发生，是导致糖尿病患者死亡的主要原因[10]。大量的氧化应激会刺激应激敏感信号系统，破坏胰岛β细胞功能，胰岛素分泌减少，最终导致胰岛β细胞凋亡及胰岛素抵抗，增加葡萄糖的耐受，进而诱发2型糖尿病[11]。另外氧化应激微血管病变中也具有重要作用，大量的活性氧可直接导致大量心肌细胞凋亡，最终导致心力衰竭[12]

糖尿病模型Kkay小鼠是国内外较为常用的自发性糖尿病模型[13]。此小鼠携带有肥胖的易感基因，在高脂饲料诱导下，喂养4周后小鼠即出现肥胖，高血糖，胰岛素抵抗，高脂血症，发病机制是高脂肪饮食的摄入[14]，因此其能更好的模拟糖尿病是有遗传因素和环境因素相互作用引起的。本研究可以发现Kkay小鼠体重和血糖显著高于对照C57组，同时Kkay小鼠长期处于较高的氧化应激状态， kkay组小鼠血清TCH、TG及LDL-C水平显著高于C57组，出现显著脂质代谢紊乱。

发达国家往往由于其食物以高脂肪高蛋白的食物为主，其糖尿病的患病率较高，而过去以淀粉为主食的包括我国在内东亚国家脂肪和蛋白质的摄入量增加，糖尿病的患病率也增加，其饮食结构的改变主要体现在高热量饮食[15]。饮食控制对肥胖及糖尿病患者来说是最经济、最有效的控制手段之一。饮食控制的主要是能量的限制，即热量限制(CR)。热量限制是指减少20%～40%日常所需摄入的能量，而保证必须营养素的摄入，保证正常的生理功能[16]。热量限制不仅可以预防多种迟发性疾病，延缓衰老，延长寿命[17]，而且在糖尿病等心血管疾病中发挥重要作用。Gao等研究发现，对高脂喂养的C57给予40%的热量限制，可以减轻肥胖小鼠的体重，恢复小鼠的糖耐量，提高机体对胰岛素的敏感性，延缓向糖尿病的转归[18]。Lean对157例糖尿病患者给予度低热量饮食，干预3-5个月，之后随访12个月发现高达46%的患者糖尿病症状完全缓解，不需要药物就可控制良好[19]。本研究同样发现，对Kkay小鼠热量限制后，其体重和血糖显著降低；CR组血清TCH、TG及LDL-C水平显著降低，Kkay小鼠血清SOD和GSH-Px水平升高，小鼠的氧化应激和脂质代谢发生显著改善。这与Ishida等研究相似，其机制可能是热量限制通过氧化应激等途径使β细胞的特异性转录因子的表达具有可逆性，β 细胞去分化显著降低。改善胰岛β细胞功能[20]。因此我们认为热量限制可以改善糖尿病小鼠氧化应激和血脂代谢，为糖尿病的治疗提供新的思路。