肺浸润性腺癌组织中去泛素化酶USP17与基质金属蛋白-9 的表达研究*

张胜超， 陈 浩， 秦 宣， 徐正浪，姚俊霞

复旦大学附属中山医院青浦分院 (上海 201700)

肺浸润性腺癌临床较为常见，常见于中老年人，与机体基因表达失常的关联性较强。去泛素化酶是蛋白酶家族，能特异性调节酶蛋白和底物结合，调节细胞周期及肿瘤细胞的增殖[1]。去泛素化酶USP17(USP17)蛋白酶家族中的重要成员，其对肿瘤细胞的增殖可能有一定作用[2]。USP17的作用需要网格蛋白介导的表皮生长因子受体参与，通过调节Ras、Myc和MMPs等蛋白促进迁移[3]。MMP-9是基质金属蛋白酶家族中的经典成员，是明胶酶的一种，可以有效降解基底膜，为转移提供通路[4]。USP17与MMP-9在肺腺癌中的表达及相关性尚未见报道。本研究应用免疫组化方法针对肺浸润性腺癌术后组织进行二种蛋白的检测，分析其意义。

资料和方法

1 一般资料 选择2014年1月至2016年12月在我院确诊为肺浸润性腺癌的患者共75例作为观察组，男35例，女40例，年龄40～86(63.1±6.2)岁。纳入标准：①符合WHO中肺浸润性腺癌的病理学诊断标准；②原发肿瘤。排除标准：①转移性腺癌；②合并其它器官恶性肿瘤；③有呼吸系统先天发育异常；④术前行放、化疗者。选择正常肺组织32例作为对照组，男女各16例，年龄42～79(62.2±5.9)岁。均留取石蜡包埋组织，两组常规资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。研究经伦理委员会批准，纳入对象家属签属知情同意书。

2 USP17和MMP-9的检测 USP17和MMP-9的表达应用免疫组化二步法。选上海汉尹生物科技有限公司的USP17和MMP-9试剂。以50为梯度分组先行预实验染色后，由病理医师对结果进行判读，选择USP17是1∶50、MMP-9是1∶100的显色最佳的浓度进行实验。正式实验均由同一实验师一次完成、DAB显色，严格按说明书进行操作，做好质控工作。

3 结果判定 免疫组化判定：二种蛋白阳性部位是细胞质，按二维方法进行客观评分，即：着色强度：无、弱、中、强分别计为0、1、2、3分：阳性率：随机选择2个400倍显微镜下的视野，以<5%、5%～10%、11%～30%、31%～50%、>50%分别计为0、1、2、3、4分。二者相加为总分(0～7分)，阴性标准为≤3分，阳性标准为>3分。以上均由病理医师盲法评价。

4 统计学方法 采用SPSS17.0统计学软件对数据进行相关分析，行卡方或t检验、方差分析、生存分析和线性相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

结果

1 两组中USP17和MMP-9蛋白的表达 两组中USP17和MMP-9表达的阳性率差别有统计学意义，见表1、图1～4。

图1 肺腺癌中USP17阳性表达(IHC 400倍)

图2 肺腺癌MMP-9阳性表达(IHC 200倍)

图3 正常肺组织中USP17阴性表达(IHC 100倍)

图4 正常肺组织中MMP-9阴性表达(IHC 100倍)

组 别nUSP17+-χ2值P值MMP-9+-χ2值P值观察组7533(44.0)42(56.0)7.8860.00540(53.3)35(46.7)10.9460.001对照组325(15.6)27(84.4) 6(18.8)26(81.3)

2 观察组中两种蛋白在不同临床病理特征中的比较 观察组中USP17和MMP-9的表达量与有无癌栓、分化程度及淋巴结转移有关，USP17的表达与肿瘤的增殖指数和肿瘤大小有关，见表2。

3 观察组中USP17和MMP-9表达的相关性分析 线性相关性分析显示观察组中USP17和MMP-9的表达具有正相关性(r=0.35，P=0.0490)。

4 观察组中USP17和MMP-9的生存分析 观察组随访的终点时间5～60(19.5±6.8)月，生存分析显示USP17和MMP-9与生存时间有关(P<0.05)。即USP17和MMP-9阳性率高者生存时间短，预后差。

表2 观察组中USP17和MMP-9在不同临床病理特征中的比较[例(%)]

讨论

泛素化修饰是细胞内常见的蛋白修饰方式之一，广泛参与了机体正常生理以及病理过程。泛素化修饰的分子参与肿瘤发生发展的各个进程中，包括周期调控，抗凋亡，免疫逃逸，血管新生和侵袭转移等[5]。其中，泛素E3连接酶和去泛素化酶(DUBs)控制了泛素修饰途径的特异性，被认为是泛素修饰系统的重要部分。去泛素化酶通过水解泛素羧基末端的酯键或异肽键，将其从连接有泛素的蛋白上水解。去泛素化酶包括5个家族，分别为泛素羧基末端水解酶家族(UCHs)、泛素特异性加工酶家族(USPs)、MPN(+)/JAMM蛋白酶、卵巢肿瘤相关蛋白酶(OTU)及Ataxin-3[6]。已报道，发现去泛素化酶OTUD6B、USP9X等参与肺癌的发展[7]。USP17作为一个新发现的去泛素化酶，介导了包括炎症、细胞运动、Th17细胞发育及肿瘤发生等多个重要过程。USP17可通过调控细胞内Ras和小GTPase的活性影响细胞的增殖和运动能力[8]。不仅如此，研究还发现USP17在多种肿瘤细胞中高表达，预示着USP17很可能是一个先前未发现的致癌基因[9]。去泛素化酶USP17与非肿瘤细胞的恶性生长和侵袭密切相关。干扰USP17后，肺癌细胞的克隆形成能力和侵袭能力明显削弱，不仅如此，干扰后的肺癌中侵袭相关的蛋白MMP-3和MMP-9表达显著降低。USP17过表达能增强神经节的线粒体运输，提高细胞的增殖能力[10]。USP17具有N端的CDC25结构域，能通过催化4,5-二磷酸盐进行水解，产生二脂酰甘油，激发蛋白激酶C的过表达[11]。MMP-9作为侵袭相关蛋白，在肿瘤进展时肿瘤细胞可以高度分泌。MMP-9的作用底物是IV型和V型胶原，能直接分解基底膜中多种间质成份，有效对基质进行降解[12]。目前认为MMP-9还具有其它的作用，如对凋亡的抑制、对增殖的影响。近年也有研究认为MMP-9对肿瘤间质的血管生成有促进作用[13]。相对于缺氧诱导因子(HIF-1a)和血管内皮生长因子(VEGF)，MMP-9是相对晚期的血管生成因子，即在肿瘤进展中MMP-9对血管生成的作用更明显。MMP-9能促进CD31、CD34阳性的血管内皮的增生和繁殖[14]。

本研究结果显示观察组中USP17和MMP-9的表达明显高于对照组，提示二者高表达可以促进肺浸润性腺癌的形成过程，二者具有癌基因样的生物学作用。结果显示观察组中USP17和MMP-9的表达与癌栓及淋巴结转移密切相关，提示二者在脉管播散过程中有一定作用，也是判定肿瘤转移的风险因子。结果显示二者的表达与分化程度相关，提示二者参与细胞的幼稚到成熟的进展过程，二者对调节干细胞的转化可能也有一定的作用。由于以上因素与生物学行为及预后相关，因此检测二者的表达与判断预后可能有一定的关联，生存分析直接证实了检测二者与预后的关系，即USP17和MMP-9高表达者预后差。结果显示USP17的表达与Ki67指数和最大径有关，提示USP17是增殖相关蛋白，能引起肿瘤细胞的增殖和肿瘤的生长。相关分析显示观察组中USP17和MMP-9的表达具有正相关性，显示二者可能有协同作用，USP17可能是MMP-9的上游因子，即USP17通过MMP-9促进肿瘤细胞的迁移。但USP17和MMP-9促进肿瘤进展的机制可能完全不同。USP17具有血管生成的促进作用，但是其对血管生成因子家族相关成员的调控是间接的[15-16]。USP17分泌增加，引起肿瘤细胞生长和分化，通过调控P53和Ras等基因，引起肿瘤的形成。MMP-9可以有多种生物学功能，如通过识别ECM及细胞膜上免疫蛋白超家族粘附分子、细胞间粘附分子等介导肿瘤细胞的粘附作用，引起细胞信号传导异常，促进同质型粘附力的下降，使肿瘤细胞易于离开原发灶，使异质型粘附力增强，使肿瘤细胞具有异源性部位的定植能力。MMPs家族中相关成员(MMP-9和MMP-14)激活后，生物学功能多样化，对肿瘤细胞的进展作用明显增强，迁移加速，这可能是肿瘤转移的重要因素[17]。

总之，USP17和MMP-9在肺浸润性腺癌术后组织高表达，且具相关性，能对肿瘤的形成和发展有一定的调节作用。