COL5A2在膀胱癌组织中的表达及其与临床病理特征和预后的相关性分析

杨洪波 石 洁 叶 勇 李文成 邓兆平

膀胱癌是最常见的恶性肿瘤之一，好发于50～60岁，每年有近74，000例新诊断的病例[1-3]。在中国，膀胱癌是男性泌尿生殖系统中最常见的癌症，排名第8位。经尿道膀胱肿瘤切除术(TURBT)被认为是治疗膀胱癌的首选，但45%～80%的膀胱癌患者可能会出现疾病复发和进展，且患者再次就诊时病灶多已扩散，预后较差，其5年生存率较低[4-7]。胶原蛋白V型2链(Collagen type V alpha 2 chain，COL5A2)在免疫系统调控、血管生成和肿瘤转移等方面发挥着重要作用，其参与了结直肠癌、乳腺瘤、骨肉瘤的进展；COL5A2表达增加时，肿瘤细胞无限制増殖、血管生成速度加快，且相关细胞因子如VEGF、P53等均表达增高[8-10]。目前关于COL5A2表达与膀胱癌关系的研究较少，因此本研究拟探讨COL5A2在膀胱癌组织中的表达及其临床意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2010年5月—2013年7月在洪湖市人民医院泌尿外科行手术治疗并经病理证实的膀胱癌患者144例，年龄40～74岁，平均(57.5±17.8)岁，病程9个月～4年；其中上皮细胞癌104例、腺癌16例、鳞状细胞癌24例。符合美国国家综合癌症网(National Compre-hensive Cancer Network，NCCN)公布的2017版《Bladder Cancer，Version 5.2017，NCCN Clinical Practice Guidelines in Oncology》中关于膀胱癌的诊断标准[11]。手术切除标本后判定有无淋巴结转移。同时取距膀胱癌组织2 cm以上的正常膀胱组织为癌旁组。患者自愿提供正常膀胱组织及膀胱癌组织标本，用作分析COL5A2、基因及蛋白的表达。纳入标准：既往无精神障碍史，无心理疾患或精神疾病史；本研究经我院医学伦理委员会审批，所有患者(或患者直系亲属)均签署知情同意书。排除标准：肝、肾、心功能异常者，感染性疾病、甲状腺疾病、入院前接受放化疗治疗的其他恶性肿瘤、胆汁淤积、自身免疫性疾病；严重高血压、呼吸道疾病、周围血管性疾病或栓塞性疾病者。

1.2 COL5A2 mRNA在膀胱及膀胱癌组织中表达的测定

TRIzol试剂提取膀胱、膀胱癌组织中总RNA，测定总RNA的浓度和质量。然后使用COL5A2特异性反向引物逆转录总RNA(0.5 μg)以获得cDNA(COL5A2正向引物：GTCGCCATGCAGGGTCCGAGGTATGCGACT；COL5A2反向引物：CTCGCTTCGACATTGCCTACGAG)。反应体系为：正向引物10 μL、反向引物10 μL、RNA模版0.6 μL、超级酶混合物0.2 μL、2×μByr一步法RT-qPCR缓冲液5 μL、去RNA水3.4 μL。循环如下：95℃持续10 min，进行40个循环，持续15 s，60℃。Fast Synergy Brands Green Master Mix法在ABI 7500实时qPCR上测定miR-20a、BCL-2的相对水平。以U6作为内部对照，以2-ΔΔCt作为计算方法。

1.3 COL5A2在膀胱及膀胱癌组织中表达水平的测定

制作常规5 μm的正常膀胱组织及膀胱癌组织石蜡切片，免疫组化法测定COL5A2在正常膀胱及膀胱癌组织中的表达，高倍视野(400×)计数，无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分，同时计数；>50%为(+++)，26%～50%为(++)，6%～25%为(+)，阳性细胞≤5%为(-)，(-)及(+)归为不表达组或低表达组即为阴性，(++)及(+++)归为高表达组即为阳性。

1.4 统计分析

2 结果

2.1 癌旁组、膀胱癌组中COL5A2 mRNA水平的表达

膀胱癌组COL5A2 mRNA表达水平为2.58±0.67，癌旁组为0.68±0.24；膀胱癌组COL5A2 mRNA表达水平高于癌旁组(P<0.05)(表1)。

表1 癌旁组、膀胱癌组中COL5A2蛋白水平的表达

2.2 癌旁组与膀胱癌组中COL5A2表达的比较

免疫组化法定性分析蛋白表达水平，COL5A2阳性表达为棕褐色，膀胱癌组COL5A2阳性率高于癌旁组(79.1%vs. 2.8%)(P<0.05)(图1，表2)。

图1 COL5A2在癌旁组、膀胱癌组的表达Figure 1 Expression of COL5A2 in the paracancerous and bladder cancer groupsNote：A.Expression of COL5A2 protein in the paracancerous group；B.Expression of COL5A2 protein in the bladder cancer group.

GroupNumber of casesCOL5A2Positive(%)Negative(%)Paracancerous group1444(2.8)140(97.2)Bladder cancer group144114(79.1)30(20.9)χ219.882P<0.001

2.3 COL5A2蛋白表达与临床病理特征的关系

COL5A2蛋白表达与年龄无关(P>0.05)；与TMN分期、病理学分级、肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移、淋巴血管间隙浸润、复发有关(P<0.05)，且TMN分期越高、病理学分期越高、肿瘤最大径≥5 cm、浸润深度越深、有淋巴结转移、有淋巴血管间隙浸润、有复发，COL5A2蛋白阳性表达率越高(表3)。

表3 COL5A2蛋白表达与临床病理特征的关系

2.4 COL5A2蛋白表达水平与膀胱癌患者预后分析

COL5A2阴性组3年生存率及生存期均明显高于COL5A2阳性组(χ2=41.619、Z=15.652，P<0.001)(图2，表4)。

表4 COL5A2蛋白表达水平与膀胱癌患者预后分析

图2 COL5A2阳、阴组Kaplan-Meier生存曲线分析Figure 2 Survival curves of patients with the expression of COL5A2 in the positive and negative groups by Kaplan-Meier analysis

3 讨论

COL5A2基因编码46 kDa的核定位转录抑制蛋白，该蛋白在国内外研究中已确定与恶性肿瘤进展相关[12-13]。COL5A2最初在白血病发病机制中被发现，随后发现，其水平的过表达与人类神经细胞增殖和胶质母细胞瘤的发展有关[14]。近期研究发现，在人乳腺癌和家族性结直肠癌(Lynch综合征)患者中鉴定出COL5A2上调。COL5A2蛋白能明显抑制其下游细胞因子的转录活性，还能稳定的附着在动粒-微管上，导致有丝分裂期间纺锤体损伤进而染色体分离受阻，细胞恶性病变[15]。

COL5A2可能参与了多种人类癌症的病理过程。研究发现[16]COL5A2在结直肠癌中表达，但在正常结肠中不表达，这表明COL5A2与结直肠癌的发生有关；COL5A2在腺瘤来源的发育不良上皮细胞中明显上调；通过微阵列研究结果显示，与原位导管癌相比，浸润性乳腺癌中COL5A2的表达增加[17]，这也与细胞外基质(ECM)重塑有关，表明COL5A2与乳腺癌的肿瘤进展有关，COL5A2在骨肉瘤细胞中上调，可能被认为是骨肉瘤的诊断标志物。总之，文献综述的结论证实，COL5A2与肿瘤发生和肿瘤进展相关。本研究结果显示，膀胱癌组COL5A2 mRNA表达水平高于癌旁组，膀胱癌组COL5A2阳性率高于癌旁组，这与上述结论一致。而度表达COL5A2的肝癌细胞株增殖能力高于野生株。高表达COL5A2蛋白的肿瘤细胞黏附内皮细胞的能力强[18]，而肿瘤细胞与内皮细胞紧密结，才能穿过细胞外基质层，建立转移灶。本研究结果提示，COL5A2蛋白表达与年龄相关性不明显；与TMN分期、病理学分级、肿瘤最大径、浸润深度、淋巴结转移、淋巴血管间隙浸润、复发相关性明显，且TMN分期越高、病理学分期越高、肿瘤最大径≥5 cm、浸润深度越深、有淋巴结转移、有淋巴血管间隙浸润、有复发，COL5A2蛋白阳性表达率越高。这说明COL5A2具有促进癌细胞分化与侵袭迁移能力的作用，与国内外研究一致[19]。

近期研究发现[20]，COL5A2是结缔组织的主要纤维蛋白，是细胞外基质(ECM)中最丰富的蛋白质。COL5A2可能通过凝血、缺氧、顶端交界处、紫外线反应，促进癌细胞的进展；COL5A2对细胞增殖发挥重要作用，并能强烈抑制细胞凋亡，COL5A2可促进甲基化CpG结合蛋白MeCP2、成视网膜细胞瘤结合蛋白2、抗凋亡蛋白等癌蛋白。此外COL5A2基因突变一般发生于肿瘤的早期，COL5A2基因突变后，处于高度活化状态，且不受EGFR信号通路的调控，即使用EGFR拮抗剂阻断了上游信号转导，突变的COL5A2的仍可发挥其促肿瘤增殖作用，EGFR拮抗剂对COL5A2基因突变的恶性肿瘤患者不能发挥抗肿瘤作用。本研究结果同时显示，COL5A2阴性组3年生存率及生存期均明显高于COL5A2阳性组，说明COL5A2低表达能明显降低膀胱癌患者预后，与上述讨论一致。

综上所述，COL5A2在膀胱癌组织中表达量增加，其在膀胱癌的发生发展过程中起促进作用；COL5A2低表达的膀胱癌患者能获得较好的预后。