胃癌患者FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因的甲基化研究

白玉贤 马仲娟 苏颖玲 慕安国 谢 蕊

胃癌严重威胁人类的生命健康，其发生是由饮食习惯、遗传及环境等多种因素共同作用的结果，是一个多步骤、多基因的病变过程，包括遗传学和表观遗传学的改变[1]。近年来，表观遗传学尤其是DNA甲基化与胃癌发生、发展和预后的关系逐渐被人们广泛的关注[2-3]，目前常用的检测甲基化的方法包括经典的甲基化特异性的PCR法、经亚硫酸氢盐纯化和修饰的亚硫酸盐修饰后的限制性内切酶法、经亚硫酸氢盐修饰后的焦磷酸测序分析法、高分辨率熔解曲线分析法和亚硫酸氢钠测序法等方法分析DNA甲基化。而亚硫酸氢钠测序法因具有灵敏、深入而又准确的优点，被公认为检测DNA甲基化的首选方法之一。本研究拟用亚硫酸氢盐测序法检测胃癌患者FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因的甲基化状态。

1 材料与方法

1.1 样本来源

选取2011年7月—2013年11月期间，在哈尔滨医科大学附属肿瘤医院外科手术切除的42例经确诊的胃癌患者。其中男性22例，女性20例，年龄31～79岁，中位年龄为61岁。所有的患者于手术前均未进行化疗及放疗等治疗。所有的胃癌及癌旁对照组织(癌旁组织距癌组织5 cm以上)标本均在术后0.5 h内获取，经液氮速冻，并于-80℃中冻存。

1.2 主要仪器和试剂

基因组DNA抽提试剂盒购自美国Sigma公司；脱氧核糖核苷三磷酸混合液、ProFlex聚合酶链式反应(PCR)仪、脱氧核糖核酸ladder和Phusion高保真DNA聚合酶购自美国赛默飞世尔公司；MethylCodeTM重亚硫酸盐转化试剂盒购自美国英杰生命技术有限公司；电泳仪购自北京六一仪器厂；DNA凝胶回收试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA提取 胃癌和癌旁患者匀浆组织参照说明书对DNA进行提取。再用50 μL的无核酶水进行洗脱，-80℃保存。用上海五相仪器仪表有限公司的UV-5800型紫外分光光度计测定胃癌与癌旁组织基因组DNA的纯度和浓度。

1.3.2 引物设计 具体引物序列见表1。

表1 FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因的引物序列

1.3.3 亚硫酸氢钠修饰和PCR扩增 用亚硫酸氢盐转化试剂盒重亚硫酸盐法处理组织基因组DNA。以亚硫酸氢盐溶液修饰的DNA为模板，共50 μL的反应体系：5 μL的10×PCR溶液，1.5 μL的Mg2+溶液，1 μL的dNTP溶液，1 μL的各种引物，2 μL胃癌患者的基因组DNA溶液，0.3 μL的Taq聚合酶溶液和38.2 μL的双蒸水。扩增流程为：95℃处理180 s，95℃和53℃下处理30 s，在72℃下40 s共40个循环，最后72℃进行300 s。

1.3.4 PCR产物检测及纯化 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，电泳条带清晰，大小正确。用Axygen凝胶回收试剂盒对PCR产物进行回收纯化。

1.3.5 PCR产物克隆和测序 将pMD18-T载体与样品的PCR产物进行接连。将5 μL的结合产物与DH5α感受态细胞相转化。将含有100 μg/mL氨苄板上涂布200 μL预转化的细菌液，过夜培育至37℃恒温细胞培养箱中。克隆长出后挑克隆进行测序。

1.4 统计学方法

用SPSS 20.0软件处理数据，各基因的甲基化结果比较选择配对t检验，不同临床病理特征的患者间基因甲基化水平比较采用t检验与方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因启动子区扩增结果

扩增产物经琼脂糖凝胶电泳可见在396 bp处有FHIT基因的特异性条带，在352 bp处有hMLH1基因的特异性条带，在301 bp处有p16基因的特异性条带，在367 bp处有RAR-beta基因的特异性条带，在316 bp处有Reprimo基因的特异性条带，TIMP3基因的特异性条带出现在403 bp处，与预期复合(图1)。

图1 FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因PCR产物电泳图Figure 1 PCR products of FHIT，hMLH1，p16，RAR-beta，Reprimo and TIMP3 genes by agarose electrophoresis

2.2 亚硫酸氢盐测序法的分析FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因的启动子甲基化

42例胃癌患者胃癌组织及癌旁组织样本均应用亚硫酸氢盐测序法的分析FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因的启动子甲基化情况。每个圈均代表1个基因的CG位点。黑色实心代表发生甲基化的基因位点，白色实心代表未发生甲基化的基因位点。T代表胃癌组织，N代表癌旁组织。甲基化水平=甲基化的CG数/CG总数×100%(图2)。

图2 选取一例患者的样本展示经亚硫酸氢盐测序法分析的FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因启动子甲基化水平Figure 2 A patient′s sample was selected to demonstrate the methylation levels of FHIT，hMLH1，p16，RAR-beta，Reprimo and TIMP3 promoters by sodium bisulfite sequencing

2.3 胃癌组织中FHIT基因、hMLH1基因、p16基因、RAR-beta基因、Reprimo基因和TIMP3基因的启动子甲基化率

FHIT基因在胃癌组织中的平均甲基化率为1.5%，相应癌旁组织的平均甲基化率为1.36%，两者比较差异无统计学意义(P=0.8196)；hMLH1基因在胃癌患者组织中的平均甲基化率为4.77%，相应胃癌癌旁组织的平均甲基化率为0.48%，两者比较差异无统计学意义(P=0.1582)；p16基因在胃癌患者组织中的平均甲基化率为9.63%，而胃癌癌旁组织的平均甲基化率较癌组织略高为10.36%，两者比较差异无统计学意义(P=0.7638)；在胃癌组织中RAR-beta基因的平均甲基化率为4.75%，而癌旁对照组织的平均甲基化率略低为4.17%，两者比较差异无统计学意义(P=0.7295)；在胃癌患者的癌组织中，Reprimo基因的平均甲基化率为9.71%，而胃癌癌旁组织的平均甲基化率较癌组织相比明显减低为3.76%，差异有统计学意义(P=0.0079)；TIMP3基因在胃癌组织中的平均甲基化率为18.34%，相应癌旁组织的平均甲基化率为14.06%，两者比较差异无统计学意义(P=0.1094)(表2)。

2.4 不同临床病理特征胃癌组织间的Reprimo基因启动子甲基化率的比较

不同性别、年龄、临床分期、浸润深度、肿瘤直径和有无淋巴转移胃癌患者间Reprimo基因启动子甲基化率无统计学差异(P>0.05)，而不同组织分化程度胃癌患者间Reprimo基因启动子甲基化率存在统计学差异(P<0.05)(表3)。

表2 FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因在胃癌患者组织和癌旁对照组织中的平均甲基化率

表3 不同临床病理特征胃癌患者间Reprimo基因甲基化率的比较

3 讨论

癌症是一种以细胞周期紊乱，细胞失去接触性抑制而无限增殖为表现的，多种因素共同作用而引起的漫长复杂的病理过程。因此，探索胃癌的发病机制至关重要。胃癌是一系列慢性胃黏膜萎缩，之后肠上皮化生，再经历非典型增生，最终致病的复杂过程。此肿瘤发生DNA甲基化是一种重要的基因表观遗传学改变。

1987年，癌症与DNA甲基化的关系被首次报道，现已成为最重要和被研究得最清楚的表观遗传修饰形式之一。发生在胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸中的胞嘧啶上的表观遗传学改变称之为DNA甲基化[4-5]。平均100个bp基因组中就有一个胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛，其跨度大约为0.5～5 kb，一般在基因转录调控附近[6]。DNA胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛常常临近基因转录起始点附近的基因启动子区域，倘若发生了DNA胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛的甲基化，则启动子也被甲基化，称为启动子异常甲基化[7]。

目前，分析DNA甲基化的方法多种多样，经常使用的方法包含经典的甲基化特异性的PCR法[8]、经亚硫酸氢盐纯化和修饰的亚硫酸盐修饰后的限制性内切酶方法[9]、经亚硫酸氢盐修饰后的焦磷酸测序分析法[10]、高分辨率熔解曲线分析技术[11]和本研究所用的亚硫酸氢钠直接测序分析法[12-13]等。因亚硫酸氢钠测序法具有灵敏、深入而又准确的优点，被公认为测定DNA甲基化的首选方法之一。近年来的研究显示[14-16]，恶性肿瘤中FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3等基因存在甲基化现象，并且对肿瘤的分子诊断、个性化治疗和评估预后具有重要的意义。

定位于染色体的3号染色体短臂14.2的FHIT基因具有促进恶性细胞凋亡、抑制其增殖并抑制肿瘤发生、发展的作用[17-18]。位于人染色体的3号染色体短臂21.3-23的hMLH1基因于1994年在研究一种常染色体显性遗传结直肠癌Lynch综合征中被首次发掘并报道[19]，此基因的总长为58 kb，由2 268 bp的DNA上的一段碱基序列即开放阅读框和19个外显子组成，据报道很多肿瘤中hMLH1的表达均有缺失或者减少。p16基因是美国纽约Cold Spring Harbor实验室发现的抗肿瘤基因，是一种多种肿瘤的抑制性基因，直接参与细胞周期的调节，具有抗恶性肿瘤的能力。RAR-beta分子量约为50 kD，含448个氨基酸，是细胞核受体超家族成员之一，是介导维甲酸抑制肿瘤细胞生长的关键受体，可影响靶基因表达而引起一系列的抑肿瘤效应。TIMP3基因属于TIMPs家族，其启动子区高甲基化可以下调TIMP3的表达或使其表达缺失，与众多恶性肿瘤的生物学特征如生长、浸润和转移相关。

本研究采用亚硫酸氢钠测序法检测42例胃癌组织标本及42例相应癌旁组织标本中FHIT、hMLH1、p16、RAR-beta、Reprimo和TIMP3基因的甲基化水平。发现与癌旁对照组织相比，只有胃癌患者中Reprimo基因的平均甲基化率具有统计学差异。Reprimo基因启动子甲基化率与胃癌患者的组织分化程度有关，而与性别、年龄、临床分期、浸润深度、肿瘤直径和淋巴转移无关。作为一种新型的抑制肿瘤基因，Reprimo基因是Ohki等研究者在经X线照射后的细胞中分离出来的，其定位于人类染色体的2号染色体短臂23[10]。倘若Reprimo过表达，细胞周期将被阻滞于细胞DNA合成的后期，具体机制可能是通过抑制Cdc2/细胞周期素B1复合物核转位和Cdc2的活性从而调节细胞的周期[20]。Reprimo基因启动子区若发生异常甲基化能够抑制基因的转录过程，引发DNA合成后期/有丝分裂期DNA损伤检查点混乱[21]。Bernal等在32例回顾性收集的胃癌样本中，发现至少一半的样本存在Reprimo基因的高甲基化状态[22]。通过研究31例健康对照和43例胃癌患者中血浆和组织样本的Reprimo基因甲基化情况，发现95.3%的血浆和97.7%的肿瘤样本中Reprimo基因发生甲基化，而健康对照中只发生了少量的Reprimo基因甲基化率(9.7%)。因此，Reprimo基因的高甲基化率可以作为胃癌的潜在生物标记物，以便早期发现胃癌[23]。

综上所述，本研究认为胃癌中Reprimo基因启动子区胞嘧啶鸟嘌呤二核苷酸岛中存在甲基化现象，与胃癌的发生、发展有密切关系。