检测器串联法测定婴幼儿配方乳粉中多种B族维生素

2019-03-25毕晓丽张书芬应璐张爱芝张少华周子焱邢家溧李湘江

中国乳品工业 2019年2期

毕晓丽，张书芬，应璐，张爱芝，张少华，周子焱，邢家溧，李湘江

（宁波市食品检验检测研究院，浙江宁波 315000）

0 引言

B族维生素是维持人体正常机能与代谢活动不可或缺的水溶性维生素，在人体中若摄入不够或过量，都易引起机体的相应疾病[1-2]。婴幼儿配方乳粉作为婴幼儿生长发育的主要营养来源，国家强制标准[3-4]中规定了在婴幼儿配方乳粉中允许添加的8种B族维生素，并给出了限量范围。

目前我国标准体系中的检测方法基本都是针对单一的维生素进行检测分析的[5-8]，而婴幼儿配方乳粉中通常会同时添加多种维生素。文献报道的B族维生素多组分联合检测对象主要为维生素片、保健品[9-13]，基质相对简单，一般多组分联合测定使用单一检测器，且联合测定的目标化合物种类较少[14-17]。本文针对婴幼儿配方乳粉，通过优化前处理和色谱条件，利用DAD和FLD串联，建立了一种定性准确、灵敏度高，同时测定维生素B2、B3(烟酸、烟酰胺)和B6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）的方法。

1 实验

1.1 材料与试剂

核黄素、烟酸、烟酰胺、盐酸吡哆醛，盐酸吡哆醇，盐酸吡哆胺标准品(购置德国Dr.Ehrenstorfer公司)；盐酸(分析纯)，异丙醇（色谱纯），氢氧化钠(分析纯)，甲醇(色谱纯)，高氯酸(分析纯)，辛烷磺酸钠(色谱纯)，超纯水。

1.2 仪器与设备

Agilent 1260 infinity II高效液相色谱仪(工作站chemstation C.01.07 SR 3,配有DAD和FLD检测器)、FE28酸度计、Mettler-ME204电子天平、KS-300EI超声仪。

1.3 标准贮备液的配制

准确称取100.0 mg核黄素标准品，用2 mL（1∶1，体积比）盐酸溶液溶解后用水定容至100 mL，在0～4℃避光条件下保存。

分别准确称取100.0 mg烟酸、烟酰胺，相应的盐酸吡哆醛、盐酸吡哆醇、盐酸吡哆胺标准品，用浓度为0.1 mol/L盐酸溶液溶解后并定容至100 mL，配成质量浓度为1.0 mg/mL的标准贮备液，在0～4℃避光条件下保存。

1.4 样品的制备

称取待测样品5 g（精确到0.01 g）于50 mL烧杯中，加入25 mL 45～50℃的温水，涡旋混匀，超声10 min，静置冷却至室温。然后用浓度为2.5 mol/L盐酸调节试样溶液的pH值至1.7±0.1，放置约1 min后，再用浓度为2.5 mol/L氢氧化钠溶液调节试样溶液的p H值至4.5±0.2，混匀，转移至50 mL容量瓶中，用水定容至刻度后混匀,经滤纸过滤，滤液过0.45μm微孔滤膜，上机待测。

1.5 液相色谱条件

色谱柱：Waters T3柱(250 mm×4.6 mm,5μm)；柱温：30℃；DAD检测器，FLD检测器（见表1），进样量20μL。流动相A：辛烷磺酸钠1.5 g，异丙醇20 mL，甲醇70 mL，用水溶解并定容到1 000 mL后，用60%高氯酸调pH值至2.5±0.1，流动相B：甲醇。梯度洗脱程序如表2所示。

表1 检测器波长变化参数

表2 梯度洗脱参数

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的优化

水溶性维生素存在游离态和结合态两种，游离态的可以直接用水提取出来，而对于婴幼儿配方奶粉这样的复杂基质，结合态的水溶性维生素通常被基质中的蛋白质或糖等化合物偶联或包裹[19]，因此需通过一定的前处理方法在保证维生素结构稳定的情况下，将目标物提取出来。

本文选择用热水浸泡，超声波加快样品分散的方法，使游离态的维生素进入到提取液中。再优化蛋白质沉淀方法将结合态维生素提取出来，由于传统的亚铁氰化钾与乙酸锌沉淀蛋白质法会缩短色谱柱的使用寿命，本文主要对等电点沉淀的条件进行了探讨。

奶粉中的蛋白质主要为酪蛋白和乳清蛋白，等电点为4.6到4.8，GB5009.89中采用了4.5作为蛋白质沉淀的等电点。由于目前婴幼儿配方奶粉中一般添加了大量的金属元素会使溶液中的阳离子偏多，可能会造成等电点有所偏移。所以实验中考察了pH值为4.1，4.3，4.5，4.7，4.9，5.1对沉淀效果的影响；从沉淀效果来看，p H为4.1、4.3、4.5、4.7时均能达到比较好的澄清效果，上机测试回收率也均在95%～104%之间，p H值为4.9和5.1时，沉淀效果较差。可见乳粉中蛋白质沉淀对pH的要求并不十分严苛，在一定范围内都能达到比较好的沉淀分离效果，本文选取4.5±0.2作为蛋白质沉淀的等电点条件。

2.2 分析条件的选择和优化

2.2.1 流动相和梯度洗脱程序的优化

由于B族维生素属于极性化合物，它们在一定条件下可以解离成为带电荷的离子，在反相色谱柱上保留比较弱，因此本研究在参照国标的基础上在流动相中添加辛烷磺酸钠作为离子对试剂，延长待测目标物的保留时间，增加分离度。

B族维生素的结构特点决定了其受流动相的pH影响比较大。本文用60%高氯酸调节流动相A的p H,考察了p H=2.0，2.5，3.0，3.5，4.0，4.5时在联合测定中对峰型、出峰时间及分离度的影响。试验结果表明采用pH 2.0时，烟酰胺与维生素B2峰部分重叠不能实现很好的分离，当p H=2.5时，6种目标物能很好的分离，进行样品分析时杂质不会对目标物产生干扰，当pH=3.0和3.5时，烟酸、烟酰胺目标物出峰较早，样品杂质干扰大。当pH=4.0时，吡哆胺的响应值明显降低，当pH=4.5时，目标物分离的效果不是很佳。因此，确定流动相A的p H值为2.5。

通过调整流动相比例和梯度洗脱程序，更好的实现了目标物的分离。在优化后的色谱条件下，DAD与FLD串联，对实际婴幼儿配方乳粉样品进行分析，色谱图如图1所示。

图1 样品中各化合物的色谱

由图1可以看出，DAD和FLD串联，同时获得两张谱图，既发挥了DAD对目标化合物响应的广谱性，又发挥了FLD的抗干扰性和灵敏性，同时两个检测器检测结果相互对照印证，能够对目标化合物准确定性，定量结果也可以相互进行验证。

2.2.2 双检测器波长的优化

对于维生素B2、B3和B6，化合物本身的结构决定了其在DAD检测器上均具有响应，通过变换波长进行优化，实现同时检测。但对于奶粉这种复杂基质，DAD检测时，杂质干扰多，目标化合物的定性确认和灵敏度方面均具有一定的局限性。FLD是一种特异性的检测器，在灵敏度上比DAD检测器要高一到两个数量级，而且具有良好的选择性，能够有效的避免一些不发荧光成分的干扰。因此在优化DAD检测条件的基础上，与荧光检测器串联，可以达到去除干扰，提高检测灵敏度的效果。

在DAD检测器上对不同化合物进行全波长扫描获得各化合物的吸收光谱图，确定各化合物的最大吸收波长。二极管阵列检测器获取的UV光谱与其荧光激发光谱很相近，两种光谱的区别主要由光谱分辨率和光源等因素引起，实际应用中可以忽略不计[18]。因此可以利用二极管阵列检测器得到的UV光谱作为参考确定荧光检测器的激发波长，再通过发射波长全扫，确定检测的最佳发射波长程序，通过以上步骤获得的高灵敏度波长如表3所示。烟酸和烟酰胺分子结构中不含有产生荧光的结构，在荧光检测器上响应极低，这里对其不做探讨。

表3 各化合物最大吸收波长 nm

2.3 线性范围及检出限

将烟酸、烟酰胺配成质量浓度为2，4，6，8，10，20μg/mL的标准系列,维生素B2和维生素B6分别配制成质量浓度为0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，2.0，3.0，4.0μg/mL准曲线，以3倍信噪比作为方法检出限。各组分的回归方程、线性相关系数、检出限如表4所示。从表4中可以看出，各目标化合物的线性回归方程相关系数都在0.99978～0.99999之间，除了DAD测定吡哆胺的灵敏度低于国标外，其他组分的检出限均在0.002 mg/kg都达到或优于国家水平。