高抗氧化乳酸菌发酵剂的筛选及其最佳发酵条件

刘文文，李洋，李键，索化夷

(1.西南大学食品科学学院，重庆400715；2.西南大学 食品科学与工程国家级实验教学示范中心，重庆400715；3.西南民族大学 生命科学与技术学院，成都610041）

0 引 言

乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类能利用可发酵碳水化合物产生大量乳酸的细菌的通称。研究表明，乳酸菌发酵酸奶具有抗氧化[1-12]、降血压[13]、降胆固醇[14]等功效，市场上功能性乳酸菌酸奶种类日益增加，但其抗氧化功能品质却参差不齐[15]。人工合成的抗氧化剂对机体有毒副作用，人们越来越关注天然来源的抗氧化物质，如果蔬和酸奶[16-17]。

本实验以分离自牦牛酸乳中的22株保加利亚乳杆菌为发酵剂进行体外抗氧化活性测定筛选出具有高抗氧化活性的乳酸菌发酵剂，通过模拟人体胃肠道环境对高抗氧化发酵剂进行复筛，确定最佳抗性菌株，并对其最佳发酵条件进行探究，为研究新型高抗氧化性乳酸菌发酵乳奠立了基础。

1 实 验

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

二苯代苦味肼基自由基（DPPH，分析纯），丁基化羟基甲苯（BHT，化学纯），Tris-HCl（pH=8.2），二乙三胺五乙酸，FeSO4，邻苯三酚，过氧化氢，抗坏血酸（分析纯）。

实验菌株如表1所示。

表1 从牦牛酸奶中分离鉴定出的22株保加利亚乳杆菌

1.1.2 仪器

手提式不锈钢压力蒸汽灭菌器（YX 280A），电热恒温培养箱（DHP-9082），台式恒温振荡器（THZ-D），紫外可见分光光度计（T6新世纪），台式高速冷冻离心机（5810R），洁净工作台（SW-CJ-2F），微型漩涡混合器（XW-80A），电子天平（FA2004）。

1.3 方法

1.3.1 乳酸菌发酵剂及发酵乳的制备

（1）乳酸菌发酵剂的活化。将22株乳酸菌接种于10 mL液体MRS培养基,于37℃水浴中震荡培养24 h,所有菌株反复传代活化3代。

（2）发酵乳的制备。将活化三代的22株菌株涡旋摇匀，在无菌条件下各取2 mL培养液于转速为4 000 r/min下离心机中离心2 min收集菌体。菌体用灭菌生理盐水洗涤后，以4%的接种量接种于50 mL无菌牛奶中，37℃条件下培养12 h，再以发酵乳为发酵剂连续传代3次。用无菌枪头取1 mL已活化三代的发酵乳于10 mL试管中，加入3 mL灭菌蒸馏水后斡旋摇匀，于转速为4 000 r/min下离心3 min后收集上清液即为提取液。

1.3.2 抗氧化活性的测定

（1）酸奶清除DPPH自由基能力测定。参照文献[18-19]的方法，测定其DPPH自由基清除率。以不同质量浓度（0～0.30 g/L）的维生素C溶液为阳性对照，将不同菌株发酵酸奶的DPPH自由基清除率转换为维生素C浓度。

（2）酸奶对羟自由基（OH-）清除能力测定。参考文献[20]中的方法，以维生素C作为阳性对照。

（3）酸奶对超氧阴离子（O2-）清除能力测定参考文献[21]中的方法，以维生素C作为阳性对照。

1.3.3 乳酸菌的抗性能力筛选

用人工胃液与胆盐对具有高抗氧化活性的乳酸菌进行抗性实验。

（1）益生菌对人工胃液耐受性的测定。人工胃液的配置：取质量分数为0.1%的NaCl，0.175 g胃蛋白酶，加50 mL纯水溶解后，用浓度为1 mol/L的HCl（8.33 mL浓盐酸定容到100 mL），调节pH值为3.0，在超净工作台中用滤膜过滤，备用。

取5 mL活化好的菌株培养液，在无菌操作台中倒入已灭菌10 mL离心管中，经3 000 r/min心10 min收集菌体，加入5 mL灭菌生理盐水混匀制成菌悬液，取1 mL菌悬液与9 mL（pH值为3.0）的人工胃液混合，摇匀，置于恒温振荡器中培养（37℃，转速为300 r/min，并分别在0和3 h取样，用MRS琼脂培养基倾注37℃培养48 h，用平板计数法测定活菌数，计算其存活率，即

（2）益生菌对胆盐的耐受力。将活化好的菌株接种于MRS液体培养基中，在37℃恒温水浴中下静置培养12 h，按2%接种量分别接种于含0%，0.1%，0.2%，0.3%和0.5%牛胆盐的MRS-THIO培养基（MRS培养基中添加0.2%巯基乙酸钠），在37℃条件下静置培养24 h，以未接种的MRS-THIO培养基为空白对照，分别测定不同质量浓度培养基在600 nm下的吸光度，按照式（2）计算乳酸菌对胆盐的耐受能力[22]。

1.3.4 高抗氧化菌株最佳发酵条件的确定

表2为L9(34)正交因子水平结果。

表2 L9(34)正交因子水平

酸奶酸度的测定按GB5009.239—2016计算酸度。乳酸菌活菌数的计算按GB 4789.35—2010计算乳酸菌数量。感官评分标准[23]如表3所示。

1.4 数据处理

同一样品平行测定3次，结果表示为x±SD。应用Excel 2010对数据进行处理与作图，应用SPSSDuncan确定数据间的差异，差异显著水平为p＜0.05。

2 结果与讨论

2.1 乳酸菌酸奶清除DPPH自由基能力的测定

DPPH,又称1,1-二苯基-2-三硝基苯肼，是一种以氮原子为中心的大分子自由基，具有很好的稳定性，是衡量乳酸菌发酵乳体外抗氧化活性的重要指标之一，发酵乳对DPPH清除能力越高表示其抗氧化能力越强[24]。由表4可知发酵乳以及纯牛奶对DPPH自由基均有一定的清除能力，但是存在显著差异，其清除率范围为33.83%0～75.05%。其中除L14外其余菌株发酵乳的DPPH清除率均大于未发酵牛奶对DPPH自由基的清除率。贾亚婷[25]对3株乳酸菌发酵的发酵乳进行清除DPPH自由基能力的测定，其中动物双歧杆菌发酵乳BB12的DPPH自由基清除能力最强，为63.12±0.32%，其余2株乳酸菌发酵乳DPPH清除率分别为52.40%±0.12%，57.60%±0.17%。本研究中，发酵乳L8，L3，L20均表现出较高的DPPH自由基清除率，分别为75.05%±3.80%，72.22%±1.16%，69.10%±4.39%；其中L8乳酸菌发酵乳的清除能力最强，相当于质量浓度为0.1g/L维C的量，且与其他发酵乳相比差异显著（P＜0.05)。

表4 乳酸菌酸奶对DPPH自由基的清除率

2.2 乳酸菌发酵乳对羟自由基清除率的测定

由表5可知，22株乳酸菌发酵剂发酵的酸乳对羟自由基表现出不同的清除能力，其范围为28.64%～72.47%，均高于未发酵的牛乳对羟自由基清除率，这表明发酵作用使得牛乳的抗氧化活性有所增加，这可能与经过乳酸菌发酵作用产生的一些活性物质如乳酸、多酚有关。谢海军[26]对嗜热链球菌、德氏乳杆菌保加利亚亚种、动物双歧杆菌及嗜酸乳杆菌等不同发酵剂发酵的酸乳进行了模拟肠道抗氧化活性测定，其中SL+BB12菌株制备的发酵乳羟自由基清除率最高，达到58.54%。本研究中，L20，L21，L22发酵乳对羟自由基清除能力分别为72.47%，71.24%，72.30%；与其他发酵乳以及谢海军等人的实验结果相比差异显著（P＜0.05)。同时L9菌株发酵的发酵乳对羟自由基清除能力较弱，只有28.64%，这说明乳酸菌的抗氧化活性存在菌株差异性，同为保加利亚乳杆菌发酵剂，表现出的抗氧化能力也有所不同。

表5 乳酸菌酸奶对羟自由基的清除率

2.3 乳酸菌发酵乳对超氧阴离子清除作用的测定

由表6可知，22株乳酸菌发酵乳都具有一定的超氧阴离子自由基清除能力，但清除能力较弱且差异不大，超氧阴离子清除范围为12.51%～37.38%，但均比未发酵已灭菌牛乳对超氧阴离子的清除能力强。本实验中，L1、L10、L22这三株乳酸菌发酵乳的超氧阴离子清除能力都较强，分别为34.38%、33.88%、34.40%，均大于0.2 mg/mL维C的清除率，且与其他菌株差异显著（P＜0.05)。

试验对22株乳酸菌发酵乳的抗氧化活性进行研究，发现其抗氧化能力不同且差异显著，L1、L3、L8、L10、L20、L21、L22分别在清除DPPH自由基、清除羟自由基、清除清除超氧阴离子自由基等方面能力突出。将上述菌株作为抗氧化能力较强的乳酸菌在模拟胃肠道环境中进行复筛。

2.4 乳酸菌的抗性试验

2.4.1 乳酸菌抗人工胃液能力

人体胃液的酸度是一个不断变化的过程，但通常都维持在pH 3左右，而益生菌必须要在高酸度的肠胃环境下保持一定的存活率才能在人体内发挥益生作用。试验将筛选得到的7株高抗氧化活性乳酸菌继续在p H=3的人工胃液中进行复筛。由表7可知，7株菌株中只有L1和L8这2株菌株存活率达20%以上，其中L1存活率最高为50.81%，与其他菌株差异显著（P＜0.05）。刘宏宇等[27]对10株乳酸菌的抗人工胃液能力进行研究，发现在p H=3.0的人工胃液中菌株培养3 h后存活率的差异很大，只有其中3株存活率在50%以上，其余菌株基本在人工胃液中不能存活。

表6 乳酸菌酸奶对超氧阴离子的清除率

表7 乳酸菌在人工胃液中的存活率

2.4.2 乳酸菌的抗胆盐能力

试验分别设置0.1%、0.3%和0.5%这3个胆盐浓度梯度，对7株乳酸菌做了对胆盐的耐受试验。随着胆盐浓度增大，乳酸菌生长效率呈下降趋势。7株乳酸菌中，L1对胆盐的耐受力最强在浓度0.3%时，其生长效率可达20%以上，为21.02%，胆盐浓度0.5%时，L1菌株生长效率为10.23%，其他菌株的生长效率都较差。刘珊春[23]测定19株乳酸菌对胆盐耐受力时，胆盐浓度为0.5%时，19株菌株的生长效率都小于10%，明显低于本实验生长效率。

表8 乳酸菌在胆盐中的生长效率 %

综合实验对22株菌株的抗氧化活性及抗性试验来看，L1菌株为筛选出的高抗氧化性菌株，且在人工胃液与胆盐中的存活率与生长效率也较高，确定其为目标菌株。

2.5 高抗氧化性乳酸菌最佳发酵条件工艺的确定

2.5.1 正交试验结果

在无菌操作台里将筛选出的菌株L1接种到已灭菌的牛乳中，按照不同温度、不同接种量、不同发酵时间、不同白糖添加量设计4因素3水平正交实验。

表9 正交实验结果

2.5.2 正交试验趋势图

2.5.2.1 4因素对酸度值的影响

由图1可知，发酵温度对发酵乳酸度值影响最大，其次是发酵时间、白糖添加量与乳酸菌接种量。因为发酵乳在酸度为70～80°T时饮用口感最佳，所以其四因素最优水平为A3B2C2D3。而发酵乳酸度值随着接种量与发酵时间的增加出现先增加后减小的趋势，这可能是由于无法满足随着接种量和发酵时间的增加乳酸菌生长对营养物质的需求所造成。

图1 不同发酵条件对酸度值的影响

表10 正交实验结果

2.5.2.2 4因素对活菌数的影响

我国《发酵乳》标准中规定，除了发酵之后热杀菌的产品外，其余产品要求乳酸菌中活菌数≥106mL-1。由图2可知，不同发酵条件下发酵乳中乳酸菌活菌数均到达标准要求，且最优组合为A3B2C2D3。温度是影响乳酸菌的生长繁殖的重要因素。同时发酵乳中乳酸菌活菌数随着接种量和发酵时间的在增加出现先增加后减小的趋势，这可能是由于无法满足随着接种量和发酵时间的增加乳酸菌生长对营养物质的需求所造成。

图2 不同发酵条件对活菌数的影响

2.5.2.3 4因素对感官评分的影响

白糖添加量不同极大地影响了感官评价，这是因为随着白糖添加量的增加中和了乳酸菌发酵产生的乳酸，使得发酵乳口感更佳的酸甜可口。随着接种量增加，乳酸菌发酵产生更多的乳酸导致发酵乳的感官评分有所下降。由图3可知感官评分达到最优的发酵条件为A3B2C1D3。

图3 不同发酵条件对感官评分的影响

2.5.3 最佳发酵工艺参数

由正交试验结果与趋势图得出最优组合水平为A3B2C2D3与A3B2C1D3。最优水平组合中就只有C（发酵时间）因素不同，C因素中两个水平里1对感官评分影响较大。感官评分与酸度值及活菌数综合比较而言，感官评价对酸奶总体的影响要大一点，所以选择组合A3B2C1D3为更优工艺条件，即发酵温度42℃，乳酸菌接种量4%，发酵时间7 h，白糖添加量8 g/mL时得到的发酵酸奶呈凝固状态无乳清析出、色泽均一、口感细腻、酸甜适中，具有凝固型酸奶所具有的香味。此时酸奶酸度79.95oT、活菌数12.7×106mL－1，感官评分88分。

3 结 论

高抗氧化型乳酸菌酸奶能帮助人体清除体内的自由基，达到预防细胞氧化，增强免疫力的功能。通过对22株保加利亚乳杆菌为发酵剂的发酵乳的体外抗氧化活性进行测定发现，与未发酵的纯牛奶相比，发酵乳具有更强的抗氧化活性，这说明牛奶经过乳酸菌的发酵作用产生抗氧化活性物质，提高了牛奶的抗氧化性能。以保加利亚乳杆菌为单一发酵剂的发酵乳对于DPPH与羟自由基具有较强的清除能力，但是清除超氧阴离子自由基能力较弱。本实验筛选出7株高抗氧化性乳酸菌L1、L3、L8、L20、L21、L22进行之后的消化道抗性实验复筛，最终确定1株最佳抗性菌株为L1，其DPPH、羟自由基、超氧及超氧阴离子清除率分别为55.07%，65.23%，34.38%，在p H值为3.0的人工胃液与质量分数为0.3%胆盐中的存活率分别为50.81%和21.02%。

通过4因素3水平正交实验确定L1菌株的最佳发酵条件为A（发酵温度）为42℃，B（乳酸菌接种量）为4%，C（发酵时间）为7 h，D（白糖添加量）为8 g/mL。此条件下发酵乳的酸度值、活菌数与感官评分总体比较都为最优状态，再次测得DPPH清除率为58.07%，羟自由基清除率为67.22%，超氧阴离子清除率29.98%，仍具有较高抗氧化活性。