肾透明细胞癌中连环蛋白-δ的表达及临床意义

鞠林成， 史亚兴， 张辉， 宋永胜， 殷波

肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)是起源于肾小管上皮的恶性肿瘤，其发病率逐年增高[1]。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是肾癌中最常见的病理类型，占肾癌的75%～80%，男性发病率高于女性[2]。肾透明细胞癌早期诊断困难，发现时多数需行根治性肾切除术，同时肾透明细胞癌对常规放化疗不敏感，一旦转移往往预后不佳。因此，研究肾透明细胞癌发生发展的分子机制有着重要的意义，探索新的分子诊断标记物对肾透明细胞癌的早期诊断、疾病进展乃至寻找新的抑制靶点有重要帮助。连环蛋白δ(δ-catenin)是连环蛋白家族中的一员，已知连环蛋白-δ与前列腺癌、乳腺癌以及非小细胞肺癌的发生发展密切相关[3-5]。本研究旨在分析连环蛋白δ在RCC中的表达及意义，报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2015年2月—2017年4月中国医科大学附属盛京医院泌尿外科收治的肾透明细胞癌101患者例作为研究对象，均行肾部分切除术或根治性肾切除术且术后病理检查确诊，术前均未行放、化疗或肿瘤相关治疗。101例中男63例，女38例，年龄29～86岁，中位年龄57.5岁；体检发现86例，因腰痛行影像学检查发现9例，因血尿行影像学检查发现6例；合并高血压22例，糖尿病13例，贫血7例；肺转移4例。肿瘤组织病理学分级采用Fuhrman分类[2]：Ⅰ级9例,Ⅱ级45例，Ⅲ级33例，Ⅳ级14例。肿瘤T分期采用美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer，AJCC)的TNM肾癌分期[6]：T1期49例，T2期25例，T3期17例，T4期10例。另选取距肿瘤边缘≥2 cm的癌旁肾组织53例作为对照组。

1.2 检测指标与方法 采用链霉素抗生物素蛋白过氧化物酶法(SP)检测连环蛋白-δ蛋白的表达以及其与各种临床病理参数间的关系。组织标本由中性福尔马林固定、石蜡包埋再制成4 μm连续切片(石蜡切片机，德国莱卡公司)，切片以二甲苯脱蜡及梯度酒精水化，经柠檬酸盐抗原修复液(pH=6.0)高压下抗原修复，再以3%过氧化氢浸泡20 min灭活内源性过氧化物酶，非免疫血清封闭。然后将切片与鼠抗人单克隆抗体连环蛋白-δ (1∶100，美国SANTA CRUZ生物公司)在4℃条件下温育过夜。磷酸缓冲液(PBS)代替一抗做阴性对照。免疫组化染色的评分参照如下标准:以细胞浆呈棕黄色者为阳性细胞，选取肿瘤细胞染色阳性集中的区域，在高倍视野(×400)下每张切片计数400个肿瘤细胞的染色情况。按染色强度分为4个等级：无染色计0分，浅黄色计1分，棕黄色计2分，黄褐色计3分；按表达百分率分4个等级：1%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计3分，>75%计4分。将阳性细胞率和染色强度得分值乘积计算为每例的积分(0～12分)，将评分结果归为阴性表达(0～3分)和阳性表达(≥4分)2组。

2 结 果

2.1 连环蛋白-δ表达比较 肾透明细胞癌患者101例癌组织中连环蛋白-δ阳性表达68例(67.3%)，高于癌旁组织53例中连环蛋白-δ阳性表达14例(26.4%)(χ2=23.370,P<0.05)。图1见封3。

2.2 临床各参数与连环蛋白-δ阳性表达的相关性分析 连环蛋白-δ阳性表达与肾透明细胞癌不同T分期、病理分级呈正相关，与患者性别、年龄、肿瘤侧别及肿瘤最大径均无相关性(P>0.05)，见表1。进一步应用二元Logistic分析结果显示，连环蛋白-δ的阳性表达仅与肿瘤患者的病理分级有显著相关性(P=0.013)，见表2。

表1 68例肾透明细胞癌临床特征及 病理与连环蛋白-δ阳性表达相关性

表2 二元Logistic分析连环蛋白-δ与 肾透明细胞癌临床病理参数的相关性

2.3 连环蛋白-δ阳性表达在肾透明细胞癌发生发展中的作用 I级肾透明细胞癌中连环蛋白-δ的阳性表达率为22.2%(2/9)，II级肾透明细胞癌中连环蛋白-δ的阳性表达率为60.0%(27/45)，III级肾透明细胞癌中连环蛋白-δ的阳性表达率为78.8%(26/33)，IV级肾透明细胞癌中连环蛋白-δ的阳性表达率为92.9%(13/14)。结果表明，肾透明细胞癌的病理分级越高，连环蛋白-δ的阳性表达越强烈。肾透明细胞癌的病理分级ROC曲线下面积为0.714，约登指数最大时(0.331)对应病理分级值>2，此时连环蛋白-δ阳性表达的敏感度为0.574，特异度为0.758。见图2，表3。

图2 肾透明细胞癌病理分级的ROC曲线

病理分级敏感度95% CI特异度95% CI约登指数01.0000.947～1.0000.0000.000～0.1060.000 1.50.9710.898～0.9960.2120.090～0.3890.183 2.50.5740.448～0.6930.7580.577～0.8890.331 3.50.1910.106～0.3050.9700.842～0.9990.161 5.00.0000.000～0.0531.0000.894～1.0000.000

3 讨 论

连环蛋白-δ属p120连环蛋白家族成员，有关文献报道p120连环蛋白家族成员多参与肿瘤的发生、发展[7]。连环蛋白-δ作为p120家族的成员之一，有关其最早的研究是在中枢神经系统，在大脑发育过程中，连环蛋白-δ在上皮细胞与神经元的黏附连接处有很强的表达，可以促进突触生长[8-9]。近来研究指出连环蛋白-δ能够通过近膜结构域(juxta membrane domain，JMD)与细胞膜上的钙黏蛋白E(E-cadherin)结合形成E-cadherin/catenin复合体促进非小细胞肺癌的恶性表型，而且连环蛋白-δ还可以通过影响小GTP酶的活性影响肿瘤细胞侵袭转移[5]。另外，连环蛋白-δ在一些肿瘤中的阳性表达与TNM分期、病理分级及不良的临床预后密切相关[10-11]。但连环蛋白-δ在肾透明细胞癌中表达情况鲜有报道。本项研究结果显示，连环蛋白-δ在肾透明细胞癌中的阳性表达与性别、年龄、侧别、肿瘤最大径及TNM分期均无相关性，仅与肾透明细胞癌的病理分级呈正相关，提示连环蛋白-δ阳性表达与肾透明细胞癌的进展存在联系。

肾癌的Fuhrman病理分级是目前应用最为广泛的分级系统，也被认为是预测肾癌预后的独立因子[2,12]，较高的Fuhrman病理分级预示着较差的临床预后。本研究采用ROC分析并得出最佳切点对应的病理分级值>2，提示在病理分级为III级或IV级的肾透明细胞癌患者中，连环蛋白-δ的阳性表达更具有临床意义即不良的临床预后，这预示连环蛋白-δ是肾透明细胞癌预后不良的一个潜在的独立危险因素。文献报道，连环蛋白-δ可以通过影响Rac1、Cdc42与RhoA等小GTP酶的活性促进淋巴管生成及肿瘤转移，在前列腺癌、乳腺癌、非小细胞肺癌中已经发现连环蛋白-δ的阳性表达与小GTP酶有关，连环蛋白-δ的阳性表达可促进癌细胞从G1期到S和G2/M期的细胞周期，显著增加肿瘤细胞的增殖促进细胞周期进展，连环蛋白-δ还可以进入细胞核并且与转录抑制因子Kaiso结合，从而缓解cyclin D1的转录抑制作用[13-16]。同时，小GTP酶又是细胞骨架重构、信号转导和基因表达通路的重要调节因子[17]。因此，我们推断连环蛋白-δ可能通过影响小GTP酶活性、调节细胞骨架的重塑促进肾透明细胞癌细胞的侵袭增殖能力，以及改变细胞周期等方式影响肾透明细胞癌的发生发展。其确切机制需在肾透明细胞癌细胞系中进一步研究。

综上所述，本研究观察到连环蛋白-δ在肾透明细胞癌组织中呈显著阳性表达，并且与肾透明细胞癌的病理分级存在正相关性，与肾透明细胞癌发生、发展的生物学行为有着密切的联系。预示连环蛋白-δ可作为预测肾透明细胞癌临床预后的独立危险因素，有可能成为肾透明细胞癌诊断及治疗的新靶点，为进一步深入研究肾透明细胞癌的发病机制提供了依据。

利益冲突：无

作者贡献声明

鞠林成：收集病例，整理资料，撰写文章，修改论文；史亚兴：参与设计图表，搜集数据，参与论文修改；张辉：研究构思，参与设计实验步骤；宋永胜：实施设计课题，审核文章；殷波：统计分析数据，查找参考文献，对文章撰写提出指导意见并参与文章撰写