糖皮质激素对哮喘小鼠CD4+T细胞中miRNA-155表达调控的研究*

朱 妤，刘金玲，王建华，王晓艾

(浙江大学医学院附属儿童医院 1中医科， 2呼吸科， 浙江 杭州 310012)

哮喘是一种以气道高反应性和气道炎症为特征的辅助性T淋巴细胞2(T helper cell 2, Th2)介导的慢性炎症性疾病[1]。越来越多的证据表明，微小RNA(microRNA，miRNA)参与了哮喘的发病环节[2-3]。miRNA是一种通过促进mRNA降解或阻断蛋白质翻译而起到基因转录后调节剂作用的短链非编码RNA[4]，可通过抑制数百个靶mRNA来调节多种生物学功能。miRNA是免疫系统中基因表达的重要调节因子，miRNA表达失调与炎症性疾病密切相关[5-6]。miRNA-155在肺部各类疾病的发生发展中起到了重要的作用，并可通过调节靶向免疫系统中基因表达来参与如哮喘、肺癌、肺炎及肺纤维化等肺部疾病的发展形成[7-8]。已有研究发现miRNA-155在哮喘小鼠肺组织中高表达，具有调节免疫稳态的功能，是哮喘小鼠肺组织中表达最高的miRNA之一[9]。

免疫系统中的CD4+T细胞在过敏性炎症中起中心作用[10]，但miRNA-155在CD4+T细胞中的生物学作用尚未得到充分研究。本研究旨在通过观察哮喘小鼠CD4+T细胞中miRNA-155表达及被糖皮质激素(glucocorticoid,GC)调节的过程来探讨糖皮质激素对哮喘小鼠CD4+T细胞中miRNA-155表达调控的影响，以期对加深理解它们在致敏发病机制中的作用以及为寻找潜在的抗炎治疗靶点提供新的证据。

材 料 和 方 法

1 动物

60只雌性BALB/c小鼠(体重18～20 g； 4～6周龄)购自北京维通利华动物实验有限公司[SCXK(京)2014-0001]。所有小鼠在室温和恒湿(55%±5%)条件下，以12 h光/暗循环在EVC笼具中饲养。小鼠可随意饮用水和食物。浙江大学动物实验中心[SYXK(浙)2018-0001]动物伦理委员会批准了本研究的动物实验方案。

2 方法

2.1哮喘模型的建立 采用卵清蛋白(ovalbumin，OVA)激发致敏鼠, 按文献报道[11]的方法建立哮喘模型。在第0天和第14天，用100 μg 的OVA(S7951，Sigma)和1 mg的氢氧化铝(77161，Thermo)溶解在200 μL的生理盐水中腹腔内注射免疫刺激小鼠。然后于第22、23和24天，再次腹腔注射注入200 μg卵清蛋白。治疗组治疗时，每次激发前 1 h腹腔注射0.2 mg/kg地塞米松(Sigma)。对哮喘发病过程进行观察时,在造模后0、3、7 d各取8只小鼠检测。造模并使用地塞米松治疗时，密切观察动物机体状态，选取造模成功的存活小鼠进行检测实验并确保每组最终至少5只造模成功的存活小鼠。

2.2肺组织病理学观察 获得支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)后，收集肺组织。肺组织用4%的多聚甲醛固定24 h，包埋在石蜡中。4 μm厚度切片，按照苏木精和伊红(HE)染色步骤进行染色观察。PAS(Sigma)染色中使用6 μm厚度切片以观察量化杯状细胞增生。 染色后在Nikon显微镜上获取图像。

2.3流式细胞术分选细胞 用5 mL红细胞裂解缓冲液将小鼠脾脏组织切成小块，4 ℃、1 500 r/min离心7 min，离心后丢弃上清，用PBS洗涤细胞颗粒。用细胞冷冻培养基(1×1010/L)对细胞进行再悬浮，保存于液氮罐中。使用MoFlo(Beckman)对细胞进行染色分类。将FACS管中的液体体积调节到50 μL，并加入荧光标记的CD4和CD8抗体。细胞与Fc阻断剂一起孵育5 min，然后用抗CD4(0.1 g)和CD8(0.2 g)抗体对1×106细胞进行染色。CD8抗体标记PerCP，CD4抗体标记FITC(BD Biosciences)。将分选的细胞收集后进行进一步分析

2.4RT-qPCR分析 使用TRIzol(Invitrogen)从各组织细胞中提取总RNA。为了进行qPCR分析，使用qScript microRNA cDNA合成试剂盒(Quanta BioSciences)将总RNA逆转录为cDNA。用CFX384实时系统定量PCR(qPCR)对miRNA进行定量分析，并使用U6作为内参照。所有使用的引物均由上海生工生物工程有限公司(miRNA-155，Q0000165-1-2；U6，MQP-0201)提供，miRNA-155的正向引物序列为5’-GCCTTAATGCTAATCGTGATAG-3’， 反向引物序列为3’-TTCCGTATGCATCATGTGAGTA-5’；U6的正向引物序列为5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物序列为5’-AAGAAACGATACAGATTGGAGTA-3’。分别在42 ℃和70 ℃下进行60 min热循环，进行逆转录和变性，随后进行40个扩增周期，包括95 ℃ 5 s(变性)和60 ℃ 30 s(延长)。采用2-ΔΔCt方法将miRNA-155进行量化分析。

2.5免疫组化染色 对各组小鼠肺组织的石蜡切片进行CD4的免疫组织化学染色。采用EnVision二步法进行免疫组化染色并用3，3′-二氨基联苯胺显色法显色，NIKON显微镜成像后使用IPP图像分析软件图计数和尺寸工具用于计算CD4+T细胞密度，定量组织切片中阳性免疫信号强度。

2.6ELISA实验 按照ELISA试剂盒(BD)说明书中描述方法，测定BALF中白细胞介素4(interleukin-4,IL-4)、IL-5、 IL-13和干扰素γ(interferon-γ,IFN-γ)水平。

3 统计学分析

使用GraphPad Prism 7.0软件对数据进行分析。数据以均数±标准差(mean±SD)表示，方差分析后进行单因素方差分析或非配对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 miRNA-155在哮喘小鼠中表达上调

哮喘小鼠肺组织切片病理学检查，HE染色结果显示，与对照组比较，哮喘小鼠气道炎症和黏液分泌增强,见图1A。哮喘小鼠肺组织中的miRNA-155检测结果显示哮喘组肺中miRNA-155显著上调(P<0.01),见图1B。RT-qPCR分析结果表明，与总外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)相比，miRNA-155在流式细胞术分选的CD4+T细胞中的表达升高(P<0.01),见图1C，并随接触过敏原时间的增加，miRNA-155水平显著升高(P<0.05或P<0.01),见图1D。相关性分析显示，随着造模时间的延长，动物疾病症状加重，CD4+T细胞中miRNA-155水平的表达升高与疾病进程呈正相关,见图1E。

Figure 1.Up-regulated expression of miRNA-155 in lung tissues and CD4+T cells of the asthmatic mice. A: HE staining of the lung tissues after modeling; B: RT-qPCR was used to analyze the expression of miRNA-155 in the lung tissues; C: the expression of miRNA-155 in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) and CD4+T cells from the spleen of the asthmatic mice; D: the expression of miRNA-155 in the splenic CD4+T cells of the mice sensitized for 3 d or 7 d; E: the relationship between the expression of miRNA-155 in CD4+T cells of mouse spleen and disease progression. Mean±SD.n=6～8.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsPBMCs;△P<0.05,△△P<0.01vs0 d.

图1miRNA-155在哮喘小鼠肺组织和CD4+T细胞中表达上调

2 糖皮质激素治疗改善哮喘小鼠肺炎症反应并降低miRNA-155的表达

HE和PAS染色显示，与对照组相比，哮喘组小鼠的肺组织炎性浸润显著，给予糖皮质激素治疗后可明显减轻支气管周围和血管周围炎症，减少增生杯状细胞的黏液分泌,见图2A、B。RT-qPCR结果发现糖皮质激素治疗后哮喘小鼠肺组织中的miRNA-155水平显著降低(P<0.01),见图2C。对分选的脾脏CD4+T细胞中的miRNA-155表达情况检测结果显示，糖皮质激素治疗后CD4+T细胞中的miRNA-155显著下调(P<0.01),见图2D。

Figure 2.Glucocorticoid (GC) therapy reduced pulmonary inflammatory responses and the expression of miRNA-155 in the asthmatic mice. A: HE staining of the lung tissues after GC treatment; B: PAS staining of the lung tissues after GC treatment; C: the expression of miRNA-155 in the lung tissues after GC treatment; D: the expression of miRNA-155 in CD4+T cells of mouse spleen after GC treatment. Mean±SD.n=6～8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma group.

图2糖皮质激素治疗改善哮喘小鼠肺炎症反应并降低miRNA-155表达

3 糖皮质激素治疗抑制脾脏中CD4+ T细胞的水平

通过流式细胞分选对脾脏中CD4+T细胞的数量进行检测，发现糖皮质激素可抑制哮喘组小鼠脾脏中的CD4+CD8-细胞比例增加(P<0.01)，改善了Th1/Th2失衡，见图3。

4 糖皮质激素治疗抑制肺组织中CD4+ T细胞的聚集

CD4免疫组化染色结果显示，糖皮质激素治疗可改善哮喘造模引起的肺组织中CD4+T细胞的聚集(P<0.01)，改善肺组织中免疫炎症细胞的浸润,见图4。

5 糖皮质激素治疗改变BALF中细胞因子的水平

哮喘组小鼠BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平升高，用糖皮质激素治疗后，BALF中IL-4、IL-5和IL-13水平下降(P<0.01)。相比于对照组，哮喘组BALF的IFN-γ水平未改变，糖皮质激素治疗后，IFN-γ水平显著增加(P<0.01),见图5。

讨 论

过敏性疾病如哮喘和过敏性鼻炎，是造成重大卫生保健负担的常见疾病[12]。哮喘是一种以低气道炎症为特征的综合症，它影响着全世界大约3亿人[13]，这些疾病的特点是发病率高、费用高、生活质量差，估计每年治疗费用超过560亿美元[14]。哮喘发病机制至今尚不明确，关于哮喘炎症途径的调节是未来医疗防治的重点方向。治疗哮喘的一线药物是糖皮质激素[15]，它可控制哮喘的发作、缓解气道炎症反应[16]，但其作用机制尚不完全清楚。本研究希望阐明糖皮质激素对哮喘小鼠CD4+T细胞中miRNA-155表达调控的影响。

Figure 3.Glucocorticoid (GC) therapy inhibited the levels of CD4+T cells in the spleen. Mean±SD.n=6～7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsasthma group.

图3糖皮质激素治疗抑制脾脏中CD4+T细胞的生成

Figure 4.Glucocorticoid (GC) therapy inhibited CD4+T cell accumulation in the lung tissues. Mean±SD.n=5～7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsasthma group.

图4糖皮质激素治疗抑制肺组织中CD4+T细胞的聚集

在免疫系统中miRNAs可调节编码各种细胞因子和炎性介质的mRNA表达[17]，提示它们可能具有作为炎症和免疫反应调节因子的功能。miRNA已成为用于诊断和治疗许多过敏炎症疾病免疫监测中的分子标志物[18]。有研究发现miRNA-155的表达与哮喘有关[19]。miRNA-155来源于原癌基因B细胞整合簇的非编码转录本[20]，对于正常B细胞分化和抗体产生是必不可少的。我们的研究发现miRNA-155在哮喘小鼠肺组织及脾脏CD4+T细胞中的表达升高，并且随着接触过敏原时间的增加水平显著升高，提示哮喘发病过程中CD4+T细胞内存在miRNA-155的内在调节作用。对哮喘组小鼠进行了糖皮质激素的治疗后，可明显减轻支气管周围和血管周围炎症，减少增生杯状细胞的黏液分泌。糖皮质激素治疗后哮喘小鼠肺组织和脾脏CD4+T细胞中的miRNA-155表达量显著降低,提示miRNA-155可能是糖皮质激素治疗作用中的一个靶点，有希望鉴定为哮喘患者血浆中的一种可能的生物标志物。

我们发现糖皮质激素治疗后，脾脏中CD4+/CD8-细胞比例降低，肺组织中CD4+T细胞的聚集减少且肺泡中IL-4、IL-5和IL-13水平下降。CD4+T细胞及其效应细胞因子IL-4、IL-5和IL-13在变应性炎症的病理生理过程中起重要作用[21]。IL-4和IL-5促进Th2细胞分化、细胞增殖和IgE产生[22]，而IL-13是介导哮喘黏蛋白产生和气道高反应性的有效细胞因子[23]。糖皮质激素可能通过调节miRNA-155 的表达从而影响CD4+T细胞对细胞因子的调节功能，最终起到细胞因子免疫调节作用从而减缓炎症反应的发生。

Figure 5.Glucocorticoid (GC) therapy altered the levels of cytokines in the bronchoalveolar lavage fluid. Mean±SD.n=5～7.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsasthma group.

图5糖皮质激素治疗改变支气管肺泡灌洗液中的细胞因子的水平

总之，miRNA-155在OVA诱导的过敏性哮喘小鼠的肺组织和脾中CD4+T细胞表达升高，而糖皮质激素可抑制过敏性哮喘小鼠的肺组织和脾中CD4+T细胞miRNA-155表达。这些发现提示了miRNA-155可能是糖皮质激素治疗过敏性哮喘疾病的一个潜在的治疗靶点。