乙酰胆碱抑制去甲肾上腺素诱导的心肌H9c2细胞凋亡*

罗 斌，郑 茜，王林琪，邰 烨，唐俊明，陈 晋

(湖北医药学院 1生理学教研室， 2药护学院, 3口腔学院， 4公共卫生与管理学院， 湖北 十堰 442000)

大量研究表明，心力衰竭(heart failure，HF)的发病及预后与心脏的自主神经系统功能紊乱密切相关，是交感神经系统过度活跃及副交感神经系统反应异常低下所引起的综合症状[1-3]。在HF患者体内，尿儿茶酚胺和血浆去甲肾上腺素(norepinephrine，NE)水平明显升高，交感神经紧张性增强及心血管反射异常[1, 4-5]。NE主要是由交感节后神经元合成和分泌的一种神经递质，其通常负责对机体受到应激时作出反应[3]，在诱导心脏发生的应激反应中，NE会引起心肌肥大甚至心肌细胞凋亡[6]。

因此，改善自主神经系统功能失衡成为缺血性心肌保护的一个重要研究方向。研究证实，在心肌缺血发生前后的不同时点刺激迷走神经以增加其末梢递质乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)的合成与释放，均能够产生有效的心肌保护作用[7-9]。目前，通过刺激迷走神经治疗HF的机制研究仍处于初级阶段[10-11]，因此，本实验建立NE诱导心肌 H9c2细胞凋亡的模型，观察ACh对NE诱导心肌H9c2细胞凋亡的影响，研究ACh可能通过哪种信号分子发挥作用，为HF等心脏疾病提供新的治疗靶点。

材 料 和 方 法

1 细胞和主要试剂

心肌H9c2细胞株由湖北医药学院附属人民医院临床医学研究所提供。磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)、DMEM 培养基、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和胰蛋白酶(Gibico)；阿托品、ACh、NE和MTT(Sigma)；PI3K/AKT信号分子阻断剂LY294002、 ERK1/2信号分子阻断剂 PD98059、p38 MAPK信号分子阻断剂SB203580和核因子κB(nuclear factor-κB,NF-κB)信号分子阻断剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)均购自碧云天；Annexin-V-FLUOS 染色试剂盒和活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)检测试剂盒(Roche)；线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1染色；Life Technologies)。

2 方法

2.1H9c2细胞的培养及分组处理 H9c2细胞培养于含15%胎牛血清的L-DMEM培养基，置于体积分数5% CO2、37 ℃的温箱条件下培养。建立NE诱导细胞凋亡、ACh保护细胞模型及药物干预时，培养基改为2%胎牛血清培养。分别选取NE浓度为0、5、10和20 μmol/L，处理24 h，确定细胞凋亡损伤模型的最适NE浓度。

为了确定最适ACh浓度，将H9c2细胞分别用浓度为0、0.1、1和10 μmol/L 的ACh预处理1 h后，用 PBS 洗2遍，再添加NE 于培养基中作用24 h。其次，再次确定ACh是否有保护作用，实验分为6组：对照(control)组；NE(10 μmol/L)组；ACh(10 μmol/L)组；ACh+NE组；阿托品(100 μmol/L)+NE组；阿托品+ACh+NE组。阿托品于添加ACh前1 h加入。

为了研究ACh的作用机制，使用阻断剂预处理1 h后再用ACh预处理1 h，之后添加NE于培养基作用 H9c2细胞作用24 h，将H9c2细胞分为8组：(1)对照组；(2)NE组；(3)ACh+NE组；(4)阿托品+ACh+NE组；(5)LY294002(10 μmol/L)+ACh+NE组；(6)PD98059(50 μmol/L)+ACh+NE组；(7)SB203508(30 μmol/L)+ACh+NE组；(8)PDTC(50 μmol/L)+ACh+NE组。

2.2MTT法检测细胞活力 将 H9c2细胞接种于96孔培养板中，细胞生长至培养孔面积80%时，用上述分组的不同因素处理后，加入MTT(5 g/L)置于培养箱孵育4 h，离心弃上清，加入二甲基亚砜,每孔200 μL，用酶标仪检测各组吸光度(A)值。按下列公式计算细胞相对活力：细胞相对活力(%)=实验组A值/对照组A值×100%。

2.3JC-1染色测定线粒体膜电位 将H9c2细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长到培养孔面积约80%时，按照上述各实验组不同的处理因素作用后，用 PBS 洗1次，加入0.2 mL细胞培养液和0.2 mL JC-1染色工作液，充分混合后在37 ℃孵育20 min，然后吸除上清，用JC-1染色缓冲液洗涤2次，加入0.5 mL细胞培养液。在荧光倒置显微镜下随机选取5个不重复区拍摄红色与绿色荧光图片，用Image-Pro Plus 6.0软件分析5个视野红色荧光强度平均值(red mean fluorescence intensity,RMFI)与绿色荧光强度平均值(green mean fluorescence intensity, GMFI)的比值，然后对每组的各样本进行统计分析。实验重复3次。

2.4流式细胞术检测细胞内ROS生成 将 H9c2细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长到培养孔面积约80%时，按照上述各实验组不同的处理因素作用后，消化、收集细胞和上消化液，离心后弃上清液，PBS 洗1次，加入不含血清的EDTA及10 μmol/L的DCFH-DA，37 ℃孵育20 min(每3 min混匀1次，使探针和细胞充分接触)，离心弃上清，PBS 洗3次，再加入1 mL PBS重悬后用流式细胞术检测，使用488 nm激发波长，实验重复3次。结果以与对照组的荧光强度比例的百分率表示，图中峰值右移，代表平均荧光强度增强，ROS相对含量增多。

2.5流式细胞术检测细胞凋亡 将 H9c2细胞接种于24孔培养板中，当细胞生长到培养孔面积约80%时，按照上述各实验组不同的处理因素作用后，消化、收集细胞和上消化液，离心后弃上清液，PBS 洗1次，加入Binding Buffer悬浮细胞，加入Annexin V-FITC混匀后，加入PI混匀，室温、避光、反应10 min，用流式细胞仪检测。实验重复3次。激发光波长为488 nm，FITC受激发后发绿色荧光，PI发红色荧光。CellQuest 软件分析结果，结果以凋亡细胞的百分率表示，即右上象限(晚凋)+右下象限(早凋)。

3 统计学处理

用SPSS 22.0统计软件进行分析。数据均采用均数±标准差(mean±SD)表示。多组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA)，组间两两比较采用LSD法。以P<0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 MTT法检测NE和ACh对细胞活力的影响

选取浓度为0、5、10和20 μmol/L的NE处理H9c2细胞24 h，结果显示，随着NE干预浓度的增加(从10 μmol/L开始)，细胞活力显著降低，并低于50%，呈明显的剂量依赖关系(P<0.05)，见图1A。因此，选择10 μmol/L作为NE的损伤浓度用于后续实验。

选取浓度为0、0.1、1和10 μmol/L 的ACh预处理H9c2细胞1 h，后加入NE(10 μmol/L)诱导细胞损伤，结果显示，10 μmol/L的ACh作用最大，可使细胞活力显著升高(P<0.05)，见图1B。因此，选择10 μmol/L作为ACh的最适浓度用于后续实验。

Figure 1.The viability of the H9c2 cells treated with NE and ACh at different doses was measured by MTT assay. A: the H9c2 cells were treated with different doses of NE for 24 h; B: the H9c2 cells were treated with different doses of ACh for 1 h and then 10 μmol/L NE for 24 h. Mean±SD.n=6.*P<0.05vs0 μmol/L group;#P<0.05vsNE (10 μmol/L) group．

图1MTT法实验检测NE和ACh对心肌H9c2细胞活力的影响

2 激光共聚焦成像观察JC-1法测定的线粒体膜电位的变化

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件，红色提示膜电位正常，绿色提示膜电位降低，通过JC-1从红色荧光到绿色荧光的转变(RMFI与GMFI的比值降低)可以很容易地检测到线粒体细胞膜电位的下降。与NE 组比较，ACh+NE组的线粒体细胞膜电位上升(P<0.05)；与ACh+NE组比较，阿托品+ACh+NE组线粒体细胞膜电位下降(P<0.05)。若在ACh预处理之前，分别加入PI3K信号分子阻断剂、ERK1/2信号分子阻断剂、p38 MAPK信号分子阻断剂和NF-κB信号分子阻断剂，与ACh+NE组比较，只有加入NF-κB信号分子阻断剂组的线粒体膜电位明显降低(P<0.05)，其余3组与ACh+NE组比较差异均无统计学显著性，见图2。

3 流式细胞术检测ROS生成

细胞内的活性氧簇可以氧化无荧光的DCFH而生成有荧光的DCF，流式图中峰值右移代表ROS含量增多。与NE 组比较，ACh+NE组的ROS含量明显下降(P<0.05)；与ACh+NE组比较，阿托品+ACh+NE组的ROS含量增加(P<0.05)。若在ACh预处理之前，分别加入PI3K信号分子阻断剂、ERK1/2信号分子阻断剂、p38 MAPK信号分子阻断剂和NF-κB信号分子阻断剂，与ACh+NE组比较，加入NF-κB信号分子阻断剂组的ROS含量明显增加(P<0.05)，其余3组的ROS含量与ACh+NE组比较差异均无统计学显著性，见图3。

Figure 2.JC-1 staining was used for determining the changes of mitochondrial membrane potential (×400). Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.

图2激光共聚焦成像检测心肌H9c2细胞的线粒体膜电位水平

4 流式细胞术分析细胞凋亡

Annexin V-FITC/PI染色及流式细胞术检测H9c2细胞的凋亡率。与NE 组比较，ACh+NE组的细胞凋亡率明显下降(P<0.05)；与ACh+NE组比较，阿托品+ACh+NE组的细胞凋亡率明显增加(P<0.05)。若在ACh预处理之前，分别加入PI3K信号分子阻断剂、ERK1/2信号分子阻断剂、p38 MAPK信号分子阻断剂和NF-κB信号分子阻断剂，与ACh+NE组比较，加入NF-κB信号分子阻断剂组的细胞凋亡率明显增加(P<0.05)，其余3组的细胞凋亡率与ACh+NE组比较差异均无统计学显著性，见图4。

Figure 3.DCFH staining analysis for ROS level in the H9c2 cells. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.

图3流式细胞术检测心肌H9c2细胞内的ROS水平

讨 论

细胞凋亡是由基因调控的主动有序的细胞自我消亡过程，在心肌缺血、心肌梗死及心力衰竭等心血管疾病的病理过程中广泛参与。若能阻止或减少凋亡，对于减轻由于细胞凋亡产生的心脏功能的减退，在多种心血管疾病的治疗中有着重要意义[12]。

大量研究表明，心力衰竭是交感神经系统过度活跃及副交感神经系统反应异常低下所引起的综合症状[1-3]。在心力衰竭患者体内，尿儿茶酚胺和血浆去甲肾上腺素水平明显升高。在诱导心脏发生的应激反应中，NE会引起心肌肥大甚至心肌细胞凋亡[6]。1998年 Communal等[13]应用成年大鼠心肌细胞培养模型，证实高浓度NE可引起心肌细胞凋亡。在心肌缺血发生前后的不同时点刺激迷走神经以增加其末梢递质ACh的合成与释放，均能够产生有效的心肌保护作用[7-9]。本研究使用高浓度(10 μmol/L)的NE处理心肌 H9c2细胞，模拟HF发生发展过程中高儿茶酚胺类激素的微环境，观察ACh(10 μmol/L)预处理对心肌细胞保护作用。与既往报道一致，高浓度NE可明显损伤心肌 H9c2细胞，表现为细胞存活率降低、线粒体膜电位丢失、ROS生成增多及细胞凋亡率显著增加；经ACh预处理后，细胞存活率升高、ROS生成减少，也抑制了线粒体膜电位丢失及细胞凋亡。阿托品为经典的竞争性M型胆碱受体阻断剂，能阻断ACh或胆碱受体激动药与受体结合，拮抗其对M受体的激动效应。我们观察到，在加入阿托品(100 μmol/L)后，可显著降低ACh对心肌H9c2细胞的保护作用。

Figure 4.The cell apoptotic rate was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC/PI staining. Mean±SD.n=6.*P<0.05vsACh+NE group.

图4流式细胞术检测心肌H9c2细胞的凋亡水平

虽然我们已经知道上调迷走神经系统的兴奋性或增加ACh的释放，均能够产生有效的心肌保护作用，但其具体机制仍然没有完全研究清楚。李冬玲等[14]和吴涛等[15]认为，迷走神经及其递质ACh是胆碱能抗炎和抗凋亡通路的重要组成成分，提高迷走张力或增加ACh的释放可通过活化α7nAChR及其下游信号分子发挥对缺血心肌的保护作用。在细胞内, 多种信号分子可参与炎性因子与凋亡因子的表达，如ROS、NF-κB、p38 MAPK及AKT等[14， 16]。

为了进一步研究ACh发挥保护作用的机制，在前期实验的基础上，我们在ACh预处理时，分别加入了与凋亡及炎症反应密切相关的4种信号通路分子阻断剂： PI3K/AKT信号分子阻断剂LY294002、 ERK1/2信号分子阻断剂PD98059、p38 MAPK信号分子阻断剂SB203580和NF-κB信号分子阻断剂PDTC进行干预，结果发现，只有加入NF-κB阻断剂后ACh的保护作用显著减弱。

从以上结果我们推测，ACh可以抑制高浓度的NE诱导H9c2心肌细胞凋亡，其机制可能是通过NF-κB信号分子介导的。此外，离体细胞模型与在体模型存在差异，因此，本课题组拟在心肌梗死动物模型开展进一步的研究。