金银花多糖分子量及单糖组成研究

闫光玲 张锋 金娟 丁洁 张永清 刘玉红

摘要：目的  探讨金银花分离纯化的多糖组分LTP1、LTP2、LTP3、LTP4的分子量及单糖组成。方法  通过热水提取、乙醇沉淀获得金银花粗多糖，经DEAE-52离子交换层析分离纯化，获得金银花多糖LTP1、LTP2、LTP3、LTP4，采用高效凝胶渗透色谱法测定分子量，气相色谱法测定其单糖组成。结果  LTP1重均分子量（Mw）为2016，由L-Rha、D-Ara、L-Fuc、D-Man、D-Glc和D-Gal组成，其摩尔比为1.68∶1.00∶4.42∶13.36∶7.34∶5.07。LTP2 Mw为3907，由L-Rha、D-Ara、L-Fuc、D-Man、D-Glc和D-Gal组成，其摩尔比为2.54∶6.28∶1.00∶5.38∶10.74∶10.44。LTP3 Mw为3039，由L-Rha、D-Ara、D-Glc和D-Gal组成，其摩尔比为1.00∶8.75∶2.59∶2.87。LTP4 Mw为7789，由L-Rha、D-Ara、D-Glc、D-Gal组成，其摩尔比为3.09∶1.86∶5.72∶1.00。结论  本研究通过DEAE-52纤维素柱层析分离得到了纯度较好的金银花多糖组分，并确定了其单糖组成，可为金银花多糖的深入研究奠定基础。

关键词：金银花多糖;分子量;单糖组成;高效凝胶渗透色谱法;气相色谱法

中图分类号：R284.2    文献标识码：A    文章编号：1005-5304（2019）02-0097-05

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2019.02.021

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Abstract： Objective To investigate the molecular weight and monosaccharide composition of LTP1， LTP2， LTP3 and LTP4 which were isolated and purified from Lonicerae Japonicae Flos. Methods Polysaccharide from Lonicerae Japonicae Flos was extracted by water extraction and alcohol precipitation， and purified by DEAE-52 ion-exchange column chromatography. The molecular weight and monosaccharide composition of LTP1， LTP2， LTP3 and LTP4 were determined by high performance gel permeation chromatography （HPGPC） and gas chromatography （GC）. Results The Mw of LTP1 was 2016， which was composed of L-Rha， D-Ara， L-Fuc， D-Man， D-Glc and D-Gal in a molar ratio of 1.68：1.00：4.42：13.36：7.34：5.07. The Mw of LTP2 was 3907， which was composed of L-Rha， D-Ara， L-Fuc， D-Man， D-Glc and D-Gal in a molar ratio of 2.54：6.28：1.00：5.38：10.74：10.44. The Mw of LTP3 was 3039， which was composed of L-Rha， D-Ara， D-Glc and D-Gal in a molar ratio of 1.00：8.75：2.59：2.87. The Mw of LTP3 was 7789， which was composed of L-Rha， D-Ara， D-Glc and D-Gal in a molar ratio of 3.09：1.86：5.72：1.00. Conclusion The pure polysaccharide is obtained by DEAE-52 cellulose column， and its monosaccharide composition is determined， which has laid the foundation for further research on polysaccharide from Lonicerae Japonicae Flos.

Keywords： polysaccharide from Lonicerae Japonicae Flos; molecular weight; monosaccharide composition; high performance gel permeation chromatography; gas chromatography

金銀花为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的干燥花蕾或带初开的花，具有清热解毒、抗炎抗菌、抗病毒的药理作用^[1-2]。前期研究发现，多糖是其有效成分之一^[3-5]。多糖是由众多单糖组成的大分子量物质，成分复杂，活性部位不明确^[6]，因而限制了金银花多糖的应用范围。在前期对金银花粗多糖的单糖组分研究的基础上^[7]，本研究对金银花粗多糖进一步分级醇沉、DEAE-52分离纯化，得到4个金银花多糖组分，采用高效凝胶渗透色谱法（HPGPC）测定其分子量，采用气相色谱法（GC）测定其单糖组成，为进一步研究金银花多糖的构效关系奠定基础，并为金银花多糖的质量控制和药理作用机制研究提供依据。

1  仪器与试药

LGJ-18冻干机，北京四环科学仪器有限公司;UV-1780分光光度计，岛津有限公司;Agilent 1100高效液相色谱仪、G1362A示差折光检测器，美国安捷伦公司;HD-3紫外检测仪，上海沪西分析仪器有限公司。

金银花（批号20160036），购于济南市百味堂中药饮片公司，经山东中医药大学李佳教授鉴定为忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thumb.的干燥花蕾或带初开的花。DEAE-纤维素52，Solarbio;葡聚糖标准品，美国Sigma公司;三氯甲烷、三氟乙酸等试剂均为分析纯。

2  方法与结果

2.1  金银花多糖的提取与分离纯化

称取金银花样品适量，加30倍量水浸泡0.5 h，85 ℃提取3次，每次1.5 h。6层纱布过滤，抽滤，合并滤液，减压浓缩，加4倍量无水乙醇，醇沉过夜，收集沉淀，真空干燥，即得金银花粗多糖^[8]。将金银花粗多糖溶解后加入水溶液1/4倍量的无水乙醇，沉淀真空干燥，得20%醇沉金银花多糖;上清液继续加原粗多糖水溶液3/4倍量的无水乙醇，沉淀真空干燥，得50%醇沉金银花多糖;上清液继续加原粗多糖水溶液3倍量的无水乙醇，沉淀真空干燥，得80%醇沉金银花多糖;采用Sevage-胰蛋白酶联合法对80%醇沉金银花多糖脱蛋白，真空干燥得金银花多糖。

取金银花多糖1.0 g，过DEAE-52离子交换柱（5.5 cm×30 cm，OH型），蒸馏水及0.1、0.2、0.3 mol/L NaCl溶液依次洗脱，流速为2.0 mL/min。采用苯酚-硫酸法跟踪，结合220 nm波长紫外检测，收集柱层析洗脱液。冻干，得金银花多糖组分LTP1、LTP2、LTP3、LTP4。

2.2  分子量测定

2.2.1  色谱条件

采用PL aquagel-OH MIXED色谱柱（7.5 mm×300 mm，8 ?m），柱温35 ℃，流动相为0.1 mol/L NaNO₃，流速1.0 mL/min，RID检测器，检测器温度40 ℃，进样量4 ?L。

2.2.2  标准品溶液的制备

精密称取分子质量为350、500、5000、12 000、25 000、50 000的葡聚糖标准品各10.00 mg，置于1 mL容量瓶中，加适量0.1 mol/L NaNO₃溶液溶解并定容，配成10 mg/mL的标准品溶液，过0.22 ?m滤膜于液相小瓶中，备用。

2.2.3  供试品溶液的制备

精密称取金银花多糖组分LTP1、LTP2、LTP3、LTP4各10.00 mg，置于1 mL容量瓶中，加适量0.1 mol/L NaNO₃溶液溶解并定容，配成10 mg/mL的供试品溶液，过0.22 ?m滤膜于液相小瓶中，供分子量测定用。

2.2.4  标准曲线的建立

按“2.2.1”项下色谱条件对“2.2.2”项下标准品溶液进行分析，每份重复进样3次，分别记录保留时间。采用Agilent Chemstation数据处理系统对数据进行分析，采用凝胶渗透色谱（GPC）软件拟合得到分子量校正曲线^[9-10]。

2.2.5  测定法

按“2.2.1”项下色谱条件对“2.2.3”项下供试品溶液进行分子量测定，根据不同分子量葡聚糖标准品，以保留时间（T）、重均分子量的对数值（lgMw）为横纵坐标做标准曲线，采用GPC软件对数据进行处理及计算。根据GPC软件处理结果，得到LTP1、LTP2、LTP3和LTP4的HPGPC图。保留时间在9.90 min附近的峰为溶剂NaNO₃峰，LTP1、LTP2、LTP3和LTP4均显示单一峰，表明金银花多糖各组分纯度较好，其重均分子量（Mw）分别为2016、3907、3039、7789。

2.3  单糖组成分析

2.3.1  金银花多糖完全酸水解

分别称取金银花多糖样品10.00 mg于具塞试管中，加入2 mol/L三氟乙酸（TFA）6 mL，使多糖完全溶解，加盖，置110 ℃烘箱水解4 h，蒸干，加甲醇5 mL，蒸干，重復3～5次，至TFA完全蒸出，供GC分析用。

2.3.2  肌醇六乙酸酯（内标）的制备及纯度检查

精密称量肌醇1.00 g、盐酸羟胺1.50 g、乙酸酐15 mL及吡啶1 mL，混合均匀，置于90 ℃水浴磁力搅拌2 h，待溶解完全后迅速倒入冰水中使其析出结晶，抽滤，烘干，得肌醇六乙酸酯，精密称取5.00 mg，用甲醇溶解并定容至5 mL，取0.5 ?L进行GC分析，呈现单一色谱峰。

2.3.3  标准单糖衍生物的制备

分别称取标准单糖L-鼠李糖（L-Rha）、D-阿拉伯糖（D-Ara）、L-岩藻糖（L-Fuc）、D-木糖（D-Xyl）、D-甘露糖（D-Man）、D-葡萄糖（D-Glc）、D-半乳糖（D-Gal）各5.00 mg，精密称定，分别加入盐酸羟胺5.00 mg、吡啶0.55 mL、内标4.00 mg，于90 ℃反应30 min。取出，冷却，加入0.55 mL乙酸酐，于90 ℃继续反应30 min，取出，氮气吹干，加入2 mL氯仿溶解，用0.45 ?m滤膜过滤，滤液备用。取标准单糖衍生物各1.00 mL，混合均匀，得混合标准单糖衍生物，供GC分析用^[7，11]。

2.3.4  水解多糖衍生物的制备

取“2.3.1”项下完全水解的金银花多糖样品5.00 mg，按“2.3.3”项下标准单糖衍生物的制备方法进行衍生化处理，加氯仿溶解，过0.45 ?m滤膜于液相小瓶中，备用。

2.3.5  色谱条件及分析

HP-5毛细管色谱柱（320 ?m×0.25 ?m，3 m），FID检测器;升温程序：初始温度170 ℃保持3 min，以2 ℃/min升温至230 ℃，保持5 min;载气：N₂;进样器温度：250 ℃;检测器温度：300 ℃;氮气流量：50 mL/min;氢气流量：30 mL/min;空气流量：50 mL/min;进样量：2.0 ?L;进样方式：分流进样;分流比：60∶1。

取“2.3.3”“2.3.4”项下标准单糖和水解多糖衍生物溶液，按上述色谱条件进样分析，根据保留时间对待测组分进行定位，并记录峰面积。相对校正因子f=A_i×m_s÷（A_s×m_i），A_i、A_s分别为待测组分和内标物质的峰面积，m_i、m_s分别为待测组分和内标物质的质量。计算各标准单糖的相对校正因子，结果见表1。

通过与标准单糖的保留时间和GC图比较，得到金银花多糖各组分的单糖组成，再根据保留时间与峰面积，由面积归一化法计算各单糖组分的摩尔比。LTP1水解产物色谱峰对应的6个单糖为L-Rha、D-Ara、L-Fuc、D-Man、D-Glc、D-Gal，其摩尔比为1.68∶1.00∶4.42∶13.36∶7.34∶5.07;LTP2水解产物色谱峰对应的6个单糖为L-Rha、D-Ara、L-Fuc、D-Man、D-Glc、D-Gal，其摩尔比为2.54∶6.28∶1.00∶5.38∶10.74∶10.44;LTP3水解产物色谱峰对应的4个单糖为L-Rha、D-Ara、D-Glc、D-Gal，其摩尔比为1.00∶8.75∶2.59∶2.87;LTP4水解产物色谱峰对应的4个单糖为L-Rha、D-Ara、D-Glc、D-Gal，其摩尔比为3.09∶1.86∶5.72∶1.00。

3  讨论

植物多糖因具有多种生物活性，目前已成为生命科学研究的重点，但由于其成分复杂、杂质较多而影响其活性。不同分子量、不同组成比例的多糖具有不同的性质，所产生的活性也有所差异。前期研究已报道了金银花多糖的单糖组分^[7]，本研究采用分级醇沉及DEAE-52阴离子交换柱层析对金银花多糖进行分离纯化，得到4个组分LTP1、LTP2、LTP3及LTP4，并对其进行分子量和单糖组成分析。

已有文献报道了金银花多糖的分子量信息^[12-13]，由于制备方法不同，故与采用HPGPC测得的分子量完全不同，本研究分离纯化获得的4个金银花多糖组分与前人制备的金银花多糖组分是不同的。关于单糖组成，本研究分离获得的组分LTP1和LTP2中含有L-Fuc，相关文献^[13-14]未见报道。本研究进一步对单糖进行了定量，通过内标计算校正因子，从而得到了分离纯化后金银花多糖组分中各单糖的摩尔比，目前尚未见其他文献涉及这项内容的研究。

多糖分子量的测定方法有凝胶滤过法、蒸气压渗透法、超速离心沉降法、黏度法、光散射法及HPGPC等^[15]，由于HPGPC具有操作简便迅速、灵敏度高且样品用量少、重复性高等优点，近年来被普遍采用。HPGPC测定多糖分子量，以水做流动相时糖链过度伸展，易造成吸附，使分子量检测值过大^[16-17]，因此，本研究采用NaNO₃溶液做流动相测定金银花多糖分子量。结果显示，LTP1、LTP4峰型较宽，表明其纯度不够，在今后研究中需要进一步纯化。

本研究采用GC进行单糖组成分析，运用衍生化方法将单糖转化成具有挥发性的衍生物，解决了多糖挥发性差、热不稳定性等问题，是单糖组成分析的常用方法^[9]。除已鉴定的单糖外，GC图中还显示有其他未知峰。由于单糖标准品有限，本研究未能确定未知峰的归属，可能是其他单糖或其他物质。根据峰面积计算，LTP1、LTP2、LTP3、LTP4中未知峰比例分别为25%、17%、19%、22%。后续研究中将收集更多的单糖标准品，进一步深入研究。

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