抗缪勒氏管激素的结构、功能、临床应用与检测技术*

林丽淑，龙韵洪，徐丽惠，冯振通，陈 睿 综述,王革非 审校

(1.深圳市福田区第二人民医院检验科，广东深圳 518049;2.汕头大学医学院微生物学与免疫学教研室，广东汕头 515041)

抗缪勒氏管激素(AMH)又称缪勒氏管抑制物(MIS)。它在胚胎的性别分化中参与早期性器官定向分化[1]。在男性睾丸生成过程，AMH于胎儿8周时开始表达，由胎儿睾丸曲精小管的支持细胞生成，诱导男性缪勒氏管退化，而乌尔夫管则发育成男性生殖系统，出生后AMH可调节男性睾丸间质细胞的功能。女性AMH于胎儿36周表达，促使缪勒氏管发育成子宫、输卵管和阴道的上部分[1]。女性AMH的来源主要为卵巢颗粒细胞生成，主要作用机制是通过减少卵泡刺激素(FSH)对窦前和小窦状卵泡的刺激生成作用抑制始基卵泡的募集和窦卵泡的发育，防止卵泡过早耗竭，从而参与卵泡的规律生成[2-3]。由此可见，AMH调节生殖管道的分化和发育，对于胚胎早期性别分化至关重要。AMH的浓度能准确地反映卵巢的储备功能，比女性年龄、抑制素B、月经第3天FSH水平、雌二醇(E2)、B超下窦状卵泡数量(AFC)更灵敏地反映卵巢储备功能，可以诊断卵巢早衰(POF)、应用于辅助生殖技术(ART)对患者制定个体化促排卵方案、诊断多囊卵巢综合征(POCS)、还可作为指导颗粒细胞瘤(GCT)的诊疗手段、为其他疾病治疗过程中的女性卵巢储备功能及生育能力评估提供依据[4]，以及男性隐睾症与无睾症的区别等[1]。可见，AMH不仅是胚胎性别分化的重要激素，还在女性内分泌激素中扮演着重要角色，还能辅助诊断男性隐睾症与无睾症，是临床某些疾病诊疗重要及可靠的手段。

1 抗缪勒氏管激素的结构

AMH是由二硫键连接而成的同源糖蛋白二聚体，相对分子质量140×103，由两个相对分子质量为70×103的单体组成，属于转化生长因子β超家庭(TGF-β)，人类AMH基因位于19号染色体短臂(19pl13.3)，长2.4～2.8×103，由含5个外显子的275对碱基组成，AMH的基因产物是AMH蛋白前体(pro-AMH)，含560个氨基酸[5]。AMH蛋白前体可水解成“可变区”N端(AMHN，相对分子质量115×103)与“成熟区”C端(AMHC，相对分子质量25×103)，AMH C端作为活性作用端与受体结合。不像其他β转化生长因子，其活化需要AMH N端残基存在[1]。AMH颗粒的生物学作用由AMH受体Ⅰ(AMHR Ⅰ)和AMH受体Ⅱ(AMHR Ⅱ)的提供，它们存在于间叶细胞。AMHR I有激活素受体类激酶ALK2、ALK3和ALK6 3种不同类型。AMH与AMHR-I没有直接的亲和力，主要通过AMHR Ⅱ 发挥生物学作用。AMH通过与AMH Ⅱ受体的结合启动与AMHR Ⅰ受体结合因此形成了二聚体的AMH复合物，该结合诱导AMHR-I酪氨酸磷酸化导致Smad蛋白复合体进入细胞核参与基因翻译[1]。

2 抗缪勒氏管激素的生理功能

在男性胚胎睾丸生成过程，AMH由胎儿睾丸曲精小管的支持细胞生成，始于胚胎第8周分泌AMH，通过旁分泌作用于缪勒氏管，从而诱导男性缪勒氏管退化，而胚胎另一套生殖管道——乌尔夫管则发育成男性生殖系统(输精管、附睾、精囊)；女性于胚胎第36周卵巢初级卵泡的颗粒细胞开始分泌AMH，缪勒氏管因此得以保留下来并发育成子宫、输卵管和阴道的上部分[1]。如果男性胚胎的睾丸支持细胞未成分泌AMH或分泌的AMH无生物学活性，或因AMH受体缺陷无法与分泌的AMH结合发挥生物学作用，将会导致如缪勒氏管永存综合征(PMDS)假两性畸形[5]。由此可见，AMH参与胚胎早期性器官定向分化，在胚胎的性别早期分化中起着非常重要作用。

AMH在女性卵巢卵泡发育中起了自分泌与旁分泌的作用，它不表达于始基卵泡，AMH由卵巢初级窦前卵泡和小窦状卵泡的颗粒细胞分泌作用抑制始基卵泡的启动；并且通过抑制细胞色素芳香化酶P450在基因和蛋白质的表达水平[5]，减少窦前和小窦卵泡对FSH的依赖性生长，参与生理性卵泡形成过程的始基卵泡募集和优势卵泡募集。从而参与优势卵泡的规律生成，是卵泡生长发育的调节因子，防止更多的卵泡消耗，保留卵巢储备[1]。免疫组织化学实验结果表明，AMH首先在初级卵泡的颗粒细胞出现，约75%次级卵泡AMH免疫组化呈阳性反应，而最强的免疫组化反应出现于窦前和小窦状卵泡，在人类卵巢，AMH持续表达于卵泡发育直到4～6 mm优势卵泡的产生。当卵泡发育至大于8 mm时，进入FSH依赖性发育阶段，几乎不分泌AMH，此阶段卵泡发育依赖FSH的分泌[6]。可见，AMH表达始于始基卵泡池的募集，不表达于优势卵泡。此外，AMH不表达于闭锁卵泡或卵泡膜细胞。体外实验证明，无AMH分泌时，初级窦状卵泡细胞到次级窦状卵泡细胞的过渡加强，导致初级卵泡池枯竭。小鼠实验还表明，不分泌AMH的鼠窦状卵泡细胞对FSH更敏感，AMH窦状卵泡细胞会降低FSH的阈值，从而增强窦卵泡对FSH的敏感性，增强小窦卵泡的生长发育，在高水平外源性FSH的作用下，卵泡的生长更快，导致更多的卵泡消耗，损耗卵巢储备功能[7]。综上所述，AMH主要通过抑制卵泡募集和发育，防止过多的卵泡消耗，使卵泡规律生成，从而发挥保留卵巢储备的作用。

AMH在人体的生理波动体现在以下方面：在男性，出生前后血清AMH水平出现短暂下降，之后升至高水平，并且持续维持稳定至青春期，随着睾酮分泌的增加，血清AMH迅速下降，并于成年后稳定维持在极低水平[8]。男性AMH的生理功能主要表现在调节睾丸间质细胞的功能，睾丸间质细胞受垂体前叶嗜碱性细胞分泌的间质细胞刺激素(黄体生成素)的作用，能合成分泌雄性激素，可促进精子的发生和男性生殖器官发育，以及维持第二性征和性功能。女性出生时血清AMH水平远远低于男性出生时的水平，出生后至青春期前AMH血清水平较低并呈复杂的上升趋势，于青春期平均24.5岁到达的AMH峰值，此后随着年龄增长，血清AMH水平逐渐下降，并于更年期急剧下降至极低水平，直到检测不出[6]。AMH在不同性别、不同年龄段具有不同分泌水平及特点，可以根据监测不同年龄段的AMH水平辅助诊断性早熟及性发育迟缓及、诊断卵巢早衰、预测更年期等。

其他影响血清AMH水平的影响还有：种族、吸烟、维生素D水平与肥胖。在美洲，黑人与西班牙女性AMH水平比白种女性低，吸烟女性AMH水平低于不吸烟女性[9]，SOWERS等[10]学者研究表明，吸烟女性比不吸烟女性的AMH水平下降更快、闭经年龄更早。我国学者研究认为中国女性AMH比白种女性更高，该研究差异是否因研究方法不同原因所导致有待探讨[11]。女性血清25-羟维生素D(25-OH-VitD)的水平与AMH水平呈正相关性，有研究推测维生素D可能作为启动AMH相关基因分泌AMH的因子。在非多囊卵巢综合征女性中，和正常体质量的女性比较，体质量指数(BMI)越高，即越肥胖的女性，其血清AMH及抑制素B(inhB)水平较BMI低的女性更低，且其AFC具有显著差异,并且肥胖者接受IVF的成功率也较正常体质量女性低[12]，目前肥胖导致AMH水平下降的机制尚不清楚，在小鼠实验中表明，脂毒性可能为肥胖女性中AMH水平下降的原因[13]。AMH的影响因素因不同学者研究人群的抽样方法、采用的方法学等不同，研究存在一定差异，对于AMH水平的不同影响因素及不同地区和人种的AMH水平还有待进一步的深入研究。

3 抗缪勒氏管激素的检测技术

AMH检测早期方法学为免疫细胞化学检测及放射免疫分析技术(RIA)，研究的检测方法主要倾向于AMH在动物组织的定位及功能研究，难以将检测应用及推广至临床诊断。AMH水平的检测报道始于上世纪90年代。第一代AMH检测为ELISA检测方法，HUDSON等[14]及LEE等[15]建立的方法灵敏度分达为0.5 ng/mL、0.7 pmol/mL。商品化试剂由DSL公司和OIT公司研发，他们使用不同的抗体及标准品，检测结果具有较大差异[16]。第二代ELISA AMH检测由贝克曼库尔特公司研发,改良优化了第一代的检测技术，使用了DSL相同的抗体及标准品，其结果大约高于第一代检测方法的22%～40%，但具有较高的相关性[17]。接着罗氏也研发了第二代ELISA AMH检测方法，其检测限(LOQ)达0.5 pmol/L[18]，研究进一步质疑血清标本在储存期间的稳定、稀释甚至标本的检测。针对有研究者发现的包括一些至2012年已取得体外诊断许可证书的第二代检测试剂盒AMH检测水平低于第一代检测试剂盒[19]。2013年7月贝克曼库尔特引进了检测前使用合适缓冲液孵育的方案，这种稀释方案可以避免补体蛋白的结合效应。另外在采集2 h内冰冻血清可提高检测准确性[20]。AnsLabs公司研发的最新一代检测试剂盒如2012年的超灵敏检测试剂、2013年的PicoAMH试剂盒，比第二代ELISA试剂盒具有更高的检测灵敏度和检测限(0.08 ng/mL)，利于低水平AMH的检出[21]。可见，对于第二代检测试剂盒 ，对于不同厂家，结果的比较和结合临床重要信息显得非常重要[22]。2014年罗氏公司率先研发了全自动电化学发光检测AMH，并且指出了不同年龄段女性的参考区间和PCOS的诊断临界值，标志AMH全自动检测的临床诊断应用的开始[23]。紧接着贝克曼库尔特也推出了全自动Access AMH检测系统[24]。VAN等[25]将罗氏公司和贝克曼公司的全自动检测系统与第二代ELISA检测方法相比，具有较好的相关性，Access AMH和Elecsys AMH检测方法与第二代ELISA检测方法的偏差分别为9%及12%，前者的检测结果比第二代ELISA检测方法的结果稍低[26]，但有很好的一致性[27]，罗氏公司和贝克曼公司全自动检测系统具有检测误差较小及分析灵敏度较高、样品稳定性好的优点，为AMH应用于临床检测提供了可靠的实验手段，为大多数用户所选择。也是目前国内外较为常用的检测系统。

4 抗缪勒氏管激素的临床应用

4.1评估卵巢储备功能 女性血清AMH水平可作为卵巢功能独特的内分泌指标，与性类固醇激素、促性腺激素和多肽类如抑制素B相比，血清AMH不随月经周期的变化而变化,可以于月经周期的任意时间检测[28]，虽然有研究表明女性AMH于黄体早期水平较低，但其在月经周期波动程度比其他性激素相比显得微不足道，并且不受怀孕与服用避孕药物的影响[1]。AMH与超声下的窦卵泡计数(AFC)呈正相关性，在作为预测闭经的血清学标志物，AMH的因此可以作为替代超声评估卵巢储备功能更经济、更方便的手段。可见血清AHM水平是比患者年龄、月经第3天的FSH水平、雌二醇水平、inhB水平、AFC更灵敏、更特异的诊断卵巢储备功能的指标，能准确可靠评估卵巢储备功能、作为女性生育能力的标志物[28]。AMH是目前女性卵巢储备功能较为可靠及稳定的血清学指标，无需指定时间即可检测，联合睾酮及胰岛素的检测对于疾病的早期诊断及治疗有积极的意义，也能诊断胰岛素抵抗性PCOS。

在肿瘤患者当中，其治疗手段如放疗与化疗与手术均有影响其卵巢储备功能的可能。化疗通过对卵泡的不良反应，使化疗后的女性AMH水平显著低于同龄健康女性,与其他药物的化疗相比，用烷化剂治疗后AMH水平显著降低甚至检测不到，化疗后AMH水平的升高取决于治疗方案的选择[29]，化疗后卵巢储备功能评估可通过检测血清AMH水平实现[30]。有研究表明，儿童肿瘤患者采用放疗与化疗治疗后的幸存者，十年后其血清AMH水平远低于健康同龄人，且患不孕症的比例更高[31]。肿瘤患者血清AMH水平在化疗后恢复到化疗前水平的概率与速度与化疗造成的卵巢损害成反比[32]。在乳腺癌患者的一项前瞻性研究表明，其术前或放疗、化疗前血清AMH水平越低，术后1年内闭经的概率越高，恢复生育能力的概率越低[33]。在卵巢囊肿手术中，不同的手术方式对卵巢储备功能的影响不同，在剥除术中选用电凝术止血比选用普通止血材料或缝合方式止血其血清AMH水平下降得更低[34]。可见，不同的治疗手段对肿瘤患者血清AMH水平的影响不同，通过AMH预测其卵巢储备功能，有利于帮助不同生育需求的患者选择合适的治疗手段，指导需要保留生育能力的女性选择适当的生育保存程序如冷冻保存胚胎、冷冻卵母细胞或卵巢组织以供治疗后移植，为患者后期生育提供了可靠的手段。

4.2在卵巢早衰的诊断及预测绝经期的应用 卵巢早衰(POF)是常见的女性病症，发病率于1%左右，发病原因主要为原始卵泡储备过少、卵泡闭锁或耗竭过快[35]。KNAUFF等[36]的研究表明，相比于传统用于诊断卵巢早衰的标志物FSH，有一部分比例患者在发生卵巢早衰时，其血清FSH低于诊断切点40 IU/mL，而血清AMH水平对于诊断卵巢早衰的敏感度接近于100%，几乎所有卵巢早衰患者血清AMH水平低于绝经参考区间，说明对于卵巢早衰的诊断大大优于FSH 。

血清AMH水平下降早于血清FSH水平的升高和B超下AFC的下降，成年女性血清AMH水平随年龄增长而逐渐下降，到了更年期，血清AMH水平降到检测不到的极低水平。多位学者的多因素研究显示，只有AMH水平可以很好地预测绝经年龄，且比年龄更能准确地预测女性绝经年龄[37]，因此血清AMH水平可以用于预测卵巢病理上的衰老和预测绝经年龄[38]。还有研究表明如果把年龄、月经周期、BMI、吸烟与否及吸烟量加入AMH进行多因素分析，可以显著提高预测10年内绝经的能力[39]。利用AMH诊断卵巢早衰具有敏感度高、检测方便、诊断效能高等特点，运用多因素分析可提高预测绝经年龄的能力。

4.3在辅助生殖技术的应用 通过AMH在辅助生殖技术(ART)作用可对患者制定个体化治疗方案，准确合理评估卵巢的储备功能及卵巢对控制性超排卵(COH)的反应性，提高妊娠率，降低并发症危险因素[40]。BROER等[41]的Meta分析表明，血清AMH水平应用于预测卵巢低反应(POR)的ROC曲线下面积(0.81)大于年龄、月经第3天FSH水平和B超下AFC，临床应用价值更高，NELSON等[42]多中心研究表明用AMH预测促排卵人群排卵数比B超下AFC更有效、更显著。通过血清AMH水平预测治疗者对激素作用下卵巢刺激(COS)反应,防止卵巢过度刺激综合征(OHSS),并选择合适治疗方案[43]。OHSS是ART促排卵过程的主要并发症之一，高AMH表示卵巢有过度刺激风险，宜制定小剂量FSH与促性腺激素释放激素(GnRh)拮抗剂治疗方案，低AMH表示卵巢低反应，应制定高剂量FSH治与GnRh拮抗剂疗方案[44-45]。有研究显示AMH与IVF出生率相关，IVF出生率与基础AMH水平呈正比。一项针对中国人的研究为促排卵人群建立了血清AMH水平用于预测卵巢刺激的切点，AMH 1.1 ng/mL为发生卵巢低反应的切点，2.6 ng/mL为卵巢过度刺激的切点[46]。AMH为辅助生殖提供了确切的切点，更精准地应用于促排卵方案的应用，极大提高了患者使用促排卵方案的安全性，减少卵巢过度刺激，为患者促排卵的有效性及身心健康提供了可能依据及保证。

4.4用于诊断多囊卵巢综合征 多囊卵巢综合征(PCOS)是女性表现为以少排卵或无排卵、高雄激素或胰岛素抵抗、多囊卵巢为特征的内分泌紊乱的症候群，是不孕症的主要病因之一。在组织学检查中，PCOS患者卵巢窦前卵泡数比正常女性高5倍，多囊卵巢的颗粒细胞分泌的AMH比健康排卵女性高75倍[47]，有研究表明，PCOS的女性的卵泡液AMH和血清AMH水平比规律排卵的女性分别高5倍与2～3倍，血清AMH用于诊断PCOS的特异性和灵敏度分别为92%与67%，并且随着AMH浓度的增高，诊断PCOS的概率越高[48]，TAL等[49]的研究表明当AMH>10 ng/mL时，PCOS的确诊率可高达97%～100%。在没有准确的超声数据情况下，AMH水平可以作为替代AFC作为诊断PCOS的标准[50],并有研究表明将AMH水平2.8～8.4 ng/mL作为不同人群的PCOS诊断切点值[51]。PCOS患者AMH水平的升高可能是由于卵泡发育的中断导致窦前和小窦卵泡累积而分泌过多AMH[50]。研究表明，在PCOS患者中，发生胰岛素抵抗的患者血清AMH水平比胰岛素敏感性正常的更高，发生闭经的PCOS患者血清AMH水平比未闭经的更高，提示高水平AMH可以反映闭经卵巢中卵泡发育中断和颗粒细胞功能的受损，可能是PCOS患者提前闭经的原因[51]。与B超相比，高水平AMH对于早期PCOS诊断具有方便快捷、确认率高的特点，AMH的高确诊率有利于PCOS的早期诊断及早期治疗。

4.5AMH在诊断卵巢肿瘤的应用 卵巢颗粒细胞瘤(GCT)发生率占所有卵巢肿瘤的3%～5%，在GCT患者中，76%～93%患者表现出AMH水平的升高[52],在肿瘤复发前16个月即可检测高浓度的AMH水平[1]。由此可见，AMH可作为GCT的血清学标志物，并且血清AMH水平与卵巢颗粒细胞肿瘤的大小呈正比关系，与影像学结果具有相关性，对GCT的治疗及复发监测有重要的临床意义[53]。基于AMH在肿瘤复发前16个月即可检测到高浓度的事实，提示卵巢颗粒细胞瘤患者定期复查血清AMH水平能更早地发现肿瘤是否复发，有助于患者及时治疗。

4.6其他应用 研究表明，AMH作为类固醇生长的辅助调节因子，存在于颗粒细胞中，在卵泡液，AMH与E2水平呈对应关系，在人类卵巢AMH在FSH依赖性的类固醇生长起了重要作用[1]。对于因促性腺激素分泌过多引起的性腺机能减退，AMH可作为子宫内化学治疗、卵巢手术、子宫内膜异位症手术等卵巢微小病变的标志物。

研究实验表明，大量卵巢上皮细胞癌起源于输卵巢管与次级缪勒氏系统，基于AMH可以导致缪勒氏管退化的事实，已有尝试使用AMH来治疗卵巢上皮细胞癌。体外研究实验表明AMH可以抑制卵巢癌上皮细胞系的增长[54]。国外也有AMH对于卵巢癌其他细胞系的作用研究，这些研究为卵巢癌提供了新思路，AMH作为人体内激素若能应用于卵巢癌治疗，相比较于其他药物治疗或放化疗，具有不良反应相对小的优点。

在无法触及睾丸的男性，美国泌尿外科学会(AUA)指南2014年指出AMH可用于判断区别隐睾症和无睾症，前者血清中检测到的AMH可证明睾丸组织的存在，对于区别无睾症简便快速，可减少隐睾症或无睾丸症的误诊。

5 小 结

目前国内对于AMH的临床运用主要体现于作为临床疾病的诊疗手段及辅助生殖技术促排卵方案选用的参考依据，但对于AMH蛋白的基础研究基本空白，随着生物技术工程研究的进展，单克隆抗原或抗体治疗技术对肿瘤细胞或相关结构选择选择性识别与破坏能力的提高，近年来许多学者致力于对新型抗卵巢癌药物的研究，以期发现更有效的治疗方案[55]。在体内外实验中，高纯度重组人AMH可在体内外抑制乳腺癌、前列腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌及卵巢细胞增殖[56-57]，笔者近期也做了AMH重组蛋白对卵巢癌SKOV3细胞系增殖凋亡影响的相关研究，初步证明AMH对该细胞系有促凋亡作用，值得进一步研究AMH对卵巢癌的作用，为卵巢癌治疗提供新思路。