红曲菌发酵特性研究

张江宁，杨春，张玲，丁卫英

(山西省农业科学院农产品加工研究所,太原 030031)

红曲是红曲霉发酵制成的产品的总称，国内外大量研究表明由于红曲含有洛伐他汀成分，因此具有明显的降胆固醇和降血脂的功效[1]，但是红曲霉发酵过程中产生的桔青霉素是对人体有害的真菌毒素，靶器官为人体肾脏，具有致癌致畸作用。因此，如何通过提高洛伐他汀、降低桔青霉素含量具有重要的意义。本实验研究红曲米发酵制备过程中碳源、氮源、碳氮比例、发酵时间、发酵温度、初始含水量、接种量、pH值对发酵过程中洛伐他汀、桔青霉素积累规律的影响，建立了提高洛伐他汀、降低桔青霉素含量的关键控制点。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甲醇、磷酸、95%乙醇、洛伐他汀标准品、桔青霉素标准品。

DIONEX UltiMate 3000 UHPLC+focused高效液相色谱仪；JY92-ⅡN超声波细胞粉碎机 宁波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 培养基及试验方法

PDA琼脂斜面培养基：马铃薯切成小块，加水煮烂，纱布过滤，灭菌，备用。

固态发酵培养基：原料20 g装入250 mL三角瓶中，蒸至物料颗粒分散、灭菌。

红曲米制作：挑取1环保藏菌种接种于斜面培养基中，于31 ℃恒温箱中扩大培养1周，接种于固态发酵培养基，培养期间通过补加水使物料的含水量保持在40%～50%，于40 ℃烘干备用。

1.2.2 洛伐他汀UHPLC测定方法[2]

发酵样品处理[3-5]：将发酵样品碾磨，水浴萃取，取5 mL萃取液微滤。

UHPLC条件：色谱柱名称：Thermo Scientific Hypersil GOLD(100 mm×2.1 mm，1.9 μm)。

1.2.3 桔青霉素含量测定方法[6，7]

发酵样品处理：固态红曲样品，40 mL TEF溶液，超声提取，40 ℃真空浓缩至干后加入60 mL甲醇溶解，进行HPLC分析。

UHPLC检测条件：色谱柱名称：Thermo Scientific Hypersil GOLD (100 mm×2.1 mm, 1.9 μm)，流动相A为纯水，流动相B为乙腈。

2 结果与讨论

2.1 不同碳源对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

碳源是红曲霉生长代谢重要的物质之一，分别加入固态发酵培养基中并制成红曲米进行比较，不同的附加碳源对固态发酵产洛伐他汀的影响见图1。

图1 不同碳源对红曲产洛伐他汀及 桔青霉素含量的影响

由图1可知，添加20%葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作为附加碳源时都能不同程度地增加桔青霉素的含量，其中果糖作为附加碳源时洛伐他汀的产量最高，达到14.3 mg/g，此时，桔青霉素含量较低，与其余几种碳源有显著差异，蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、甘油、玉米粉作为添加碳源时，桔青霉素含量较高，因此果糖可以作为最适碳源。

2.2 果糖浓度对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

图2 果糖浓度对红曲产洛伐他汀及 桔青霉素含量的影响

由图2可知培养基中不同浓度的果糖。分别选取果糖添加量为20%，30%，40%，50% 4个水平。果糖添加量小于30%时，洛伐他汀的产量不断增加。果糖量增加，洛伐他汀含量逐渐降低，桔青霉素的含量变化不大，综合考虑洛伐他汀的产量和原料利用率，最终选用浓度为30%的果糖作为培养基碳源添加量。

2.3 不同氮源对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

本实验选用6种氮源大豆粉、蛋白胨、酵母膏、NaNO3、NH4NO3与NH4Cl分别按10%添加入固态发酵培养基中并制成红曲米进行比较，检测洛伐他汀及桔青霉素的含量，实验结果见图3。

图3 不同氮源对红曲产洛伐他汀及 桔青霉素含量的影响

由图3可知，以大豆粉为附加氮源时，洛伐他汀的产量最高，桔青霉素含量较低，与其他几种氮源相比差异比较明显；蛋白胨作为添加氮源时，洛伐他汀的产量较高，但是对桔青霉素合成刺激作用最明显，含量最高；酵母膏作为添加氮源时，虽然含量不高，但是洛伐他汀的产量处于低位；NaNO3、NH4NO3与NH4Cl对洛伐他汀及桔青霉素含量的影响不显著。

2.4 氮源浓度对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

培养基中不同浓度的大豆粉对洛伐他汀及桔青霉素的影响情况见图4。

图4 氮源浓度对红曲产洛伐他汀及 桔青霉素含量的影响

由图4可知，分别选取大豆粉添加量为5%，10%，15%，20% 4个水平。大豆粉的添加量为10%时，对洛伐他汀的产生积累有较大影响，达到15.3 mg/g，对桔青霉素的产生能力影响不大，因此确定大豆粉的添加量为10%。

2.5 初始pH值对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

图5 初始pH值对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

由图5可知，分别用pH为3，4，5，6，7，水呈酸性时,有利于抑制杂菌的生长,但同时酸性过高，导致合成洛伐他汀相对减弱。随着pH 值增加，洛伐他汀的含量增大，当pH值为4.0时，洛伐他汀的产量达到最大值，桔青霉素含量较低。

2.6 发酵温度对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

分别选用发酵温度为 25，30，35，40，45 ℃发酵12天，对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响见图6。

图6 发酵温度对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

由图6可知，当温度为25 ℃时，直接影响了菌丝生长及洛伐他汀的生成量。当温度高于35 ℃后，洛伐他汀及桔青霉素产量下降，说明温度对洛伐他汀及桔青霉素的合成途径有重要影响，而不仅仅是对红曲霉细胞的生长影响，因此最适合温度为30 ℃。

2.7 发酵时间对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

分别研究发酵时间为3，6，9，12，15天时红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响见图7。

图7 发酵时间对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响

由图7可知，当培养9天时，洛伐他汀的积累量基本达到最大值，之后下降。桔青霉素发酵至第6天时迅速上升，因后期桔青霉素累积过快，前期洛伐他汀含量较低，因此综合考虑，选择培养时间为9天。

3 结论

通过单因素实验研究碳源种类及浓度、氮源种类及浓度、发酵时间、发酵温度、pH值对红曲产洛伐他汀及桔青霉素含量的影响，结果表明果糖作为附加碳源时洛伐他汀的产量最高，桔青霉素的含量较低；有机氮源洛伐他汀产量大于无机氮源，蛋白胨洛伐他汀的产量较高，对桔青霉素合成刺激作用也明显；随着发酵初始pH值增加，洛伐他汀的含量增大，当pH值为4.0时，洛伐他汀较高，桔青霉素含量较低，当pH值继续升高时，洛伐他汀产量下降；当发酵温度高于35 ℃后，洛伐他汀及桔青霉素产量下降；当培养时间达到9天时，洛伐他汀的积累量基本达到最大值，之后下降，桔青霉素发酵至第6天时迅速上升。