响应面法优化鹰嘴豆发酵纳豆工艺

罗仓学，刘晓宇，张雯

(陕西科技大学 食品与生物工程学院，西安 710021)

鹰嘴豆是一种药食两用作物，起源于中东地区和亚洲西部，是世界上种植面积较广的豆类[1]，在中国主要分布于新疆、甘肃、宁夏和青海等地[2]。鹰嘴豆相较于大豆油脂含量极低，富含人体所需的18种氨基酸、蛋白质、脂肪、粗纤维、维生素及钙、铁、镁等营养成分，具有预防高血压及动脉粥样硬化，降低胆固醇及血脂、血糖，利尿以及治疗失眠等作用[3-7]。目前，我国已广泛栽培并将其用作食品原料，但其保健作用的开发还处于研究阶段。因此，进行鹰嘴豆产品的开发与研究有着巨大的经济和生态利用价值。

纳豆是大豆蒸煮后接种纳豆芽孢杆菌，在一定条件下发酵而成的一种传统豆类发酵食品。纳豆中含有上百种生理活性物质及营养物质，且含有全部的必需氨基酸[8]。纳豆具有溶解血栓，预防骨质疏松，抗菌，抗氧化，抗癌，提高蛋白质消化率，调整肠道功能等保健作用[9]。Sumi H等[10]于1987年从纳豆中提取出具有溶栓功能的物质并命名为纳豆激酶(Nattokinase，NK)，纳豆激酶属于纳豆枯草芽孢杆菌丝氨酸蛋白酶，体内体外实验均已证明其具有高效的溶栓活性[11]，不仅可以直接溶解交联状的血栓，还可以催化血纤维蛋白原转化成有活性的血纤维蛋白原溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成，增强体内血栓的溶解活性[12]。

鹰嘴豆盛产于雪域高原，当地人通过简单的制粉工艺加工成具有保健作用的粉体食品。目前日本的纳豆产品研发处于世界领先水平，我国对纳豆发酵技术的掌握仍参差不齐。本研究在预实验的基础上筛选了鹰嘴豆作为发酵纳豆的原料，旨在通过枯草芽孢杆菌的发酵，从原料出发，以纳豆激酶活力为指标进行考核，优化鹰嘴豆的发酵条件，增强鹰嘴豆的保健作用，为鹰嘴豆资源的高价化利用开辟新途径。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鹰嘴豆：来源于新疆；枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)：本实验室筛选并保存；磷酸二氢钠、氯化钠、磷酸氢二钠、无水氯化钙：均为分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；尿激酶、纤维蛋白原：美国Sigma公司。

斜面培养基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0.02%、NaCl 0.5%、CaCl20.02%、琼脂2%。

种子培养基：牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、磷酸二氢钾0.02%、NaCl 0.5%、CaCl20.02%。

1.2 仪器与设备

YXQ-SG46-280S压力蒸汽灭菌锅 上海博讯实业有限公司；JA2603B电子天平 上海天美天平仪器有限公司；HWS12型电热恒温水浴锅 上海一恒科学仪器有限公司；MJ-250霉菌培养箱 上海百典仪器设备有限公司；HZQ-QG全温振荡器 哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；DL-CJ-1N医用型洁净工作台 北京东联哈尔仪器制造有限公司；755B紫外可见分光光度计 上海菁华科技仪器有限公司；微量移液器 德国Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 制备种子液

纳豆菌经斜面培养基活化后接种到种子培养基中，于33 ℃，120 r/min震荡培养12 h。

1.3.2 纳豆发酵工艺流程

鹰嘴豆→浸泡→蒸煮→接种→发酵→后熟→纳豆。

称取适量鹰嘴豆清洗干净，加自来水至料液比为1∶1(V/W)浸泡过夜，于120 ℃蒸煮20 min，冷却至室温后接种3%纳豆菌，于33 ℃静置发酵72 h，转入4 ℃冰箱后熟24 h。

1.3.3 纳豆激酶活性测定[13]

尿激酶的标准曲线：配制浓度梯度为5848，2924，1462，731，365.5 IU/mL的尿激酶标准溶液，分别取20 μL上述标准液点样至纤维蛋白平板上，于37 ℃孵育16 h后，测量形成的透明圈的两条垂直直径，计算其面积S=πd2/4。以溶圈面积为横坐标，以标准尿激酶活力的对数值为纵坐标，绘制标准曲线，见图1，得方程y=0.0079x+0.8712，R2=0.9975。

粗酶液的制备：取适量成熟的纳豆，加入无菌生理盐水(1∶1，V/W)，于4 ℃，120 r/min浸提1 h，提取液按4000 r/min离心20 min，上清液即为粗酶液。取20 μL粗酶液于纤维蛋白平板上点样，于37 ℃孵育16 h后，测量溶圈垂直直径，计算面积，参照尿激酶标准曲线方程计算样品粗酶液酶活。

图1 纳豆激酶活性标准曲线Fig.1 Standard curve of nattokinase activity

1.4 单因素实验

1.4.1 接种量对NK活性的影响

分别取30 g鹰嘴豆进行清洗浸泡处理后发酵纳豆。蒸煮时间20 min，基质含水量50%，发酵温度33 ℃，发酵时间72 h，后熟时间20 h，以纳豆激酶酶活性为指标，研究接种量分别为2%，4%，6%，8%，10%对NK活性的影响。

1.4.2 基质含水量对NK活性的影响

分别取30 g鹰嘴豆进行清洗浸泡处理后发酵纳豆。蒸煮时间20 min，接种量3%，发酵温度33 ℃，发酵时间72 h，后熟时间20 h，以纳豆激酶酶活性为指标，研究基质含水量分别为25%，50%，75%，100%，125%对NK活性的影响。

1.4.3 发酵时间对NK活性的影响

分别取30 g鹰嘴豆进行清洗浸泡处理后发酵纳豆。蒸煮时间20 min，基质含水量50%，接种量6%，发酵温度33 ℃，后熟时间24 h，以纳豆激酶酶活性为指标，研究发酵时间分别为24，36，48，72，96 h对NK活性的影响。

1.4.4 发酵温度对NK活性的影响

分别取30 g鹰嘴豆进行清洗浸泡处理后发酵纳豆。蒸煮时间20 min，基质含水量50%，接种量6%，发酵时间48 h，后熟时间20 h，以纳豆激酶酶活性为指标，研究发酵温度分别为28，30，32，34，36 ℃对NK活性的影响。

1.4.5 后熟时间对NK活性的影响

分别取30 g鹰嘴豆进行清洗浸泡处理后发酵纳豆。蒸煮时间20 min，基质含水量50%，接种量3%，发酵温度33 ℃，发酵时间72 h，以纳豆激酶酶活性为指标，研究后熟时间分别为12，16，20，24，28 h对NK活性的影响。

1.5 响应面实验

在单因素实验的基础上进行响应面优化实验时，选取影响较大的3个因素：接种量(因素A)、发酵温度(因素B)、发酵时间(因素C)，以NK活性为指标，采用Design Expert 8.0.6软件进行3因素3水平的设计并对所得数据进行分析，确定最佳发酵工艺。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 接种量对NK活性的影响

接种量对NK活性的影响见图2。

图2 接种量对NK活性的影响Fig.2 Effect of inoculation amount on NK activity

由图2可知，随着接种量的增大，NK活性呈现先增大再降低的趋势，这是由于接种量过小时，菌体无法在发酵液内充分生长，难以实现发酵完全；接种量较大，菌种生长繁殖较快，从而有利于产酶。而接种量继续增加，大于6%时，并没有遵循以上规律。分析原因，可能是由于接种量过大时，细胞繁殖速度过快，营养成分迅速耗竭，同时细胞快速生长导致初级代谢旺盛，次级代谢被抑制，从而导致NK产量下降。接种量为6%时，细胞生长速率适中，既能实现细胞的大量积累，又能使次级代谢过程顺利进行，因此纳豆激酶活力达到最大。因此，最佳接种量为6%。

2.1.2 基质含水量对NK活性的影响

基质含水量对NK活性的影响见图3。

图3 基质含水量对NK活性的影响Fig.3 Effect of substrate water content on NK activity

由图3可知，基质含水量对鹰嘴豆发酵后纳豆激酶活性有较大影响，当基质含水量达50%时，纳豆激酶活力达最高值。基质含水量过小，纳豆菌难以充分生长，酶产量下降；基质含水量过大，基质表面则会形成一层液态膜，造成环境供氧不足，不利于纳豆菌的生长代谢，导致酶产量较低。因此，最佳基质含水量为50%。

2.1.3 发酵时间对NK活性的影响

发酵时间对NK活性的影响见图4。

图4 发酵时间对NK活性的影响Fig.4 Effect of fermentation time on NK activity

由图4可知，NK酶活性随发酵时间的延长呈现由低到高再到低的变化趋势；在发酵24～48 h的过程中，NK酶活呈升高趋势；发酵时间为48 h时，NK活力达到最高；发酵时间超过48 h后，鹰嘴豆基质中剩余的营养物质不足以维持纳豆菌的代谢，同时次级代谢产物中副产物逐渐增多，抑制了NK的生产，从而导致NK活性降低。因此，最佳发酵时间为48 h。

2.1.4 发酵温度对NK活性的影响

发酵温度对NK活性的影响见图5。

图5 发酵温度对NK活性的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on NK activity

由图5可知，随着发酵温度的增大，纳豆激酶活性先增大后减小，发酵温度为34 ℃，时纳豆激酶活性最高；当发酵温度大于34 ℃时，鹰嘴豆的活力则逐渐减弱。微生物的生长及代谢过程都需要适宜的温度，NK的合成反应在最适温度时，则NK合成过程中的酶活力最高，一旦超过最适温度，酶的活力就会下降，NK产量会相应降低，NK活力就降低。同时温度过高会导致纳豆色泽暗淡，形态瘪软。因此，最佳发酵温度为34 ℃。

2.1.5 后熟时间对NK活性的影响

后熟能使纳豆在发酵过程中产生的物质进行平衡，同时减少纳豆中的不良风味，并使纳豆风味变得更加浓郁。后熟时间对NK活性的影响见图6。

图6 后熟时间对NK活性的影响Fig.6 Effect of ripening time on NK activity

由图6可知，随着后熟时间的增大，纳豆激酶的活性呈现先增大后缓慢下降的趋势，可能是由于随着后熟时间的延长，产生了特殊的活性物质，抑制了纳豆激酶的活性，导致NK活性降低，也可能是纳豆激酶发生了转化或降解作用。因此，后熟的适宜时间选择20 h。

2.2 响应面优化实验结果与分析

根据Box-Behnken实验设计原理，综合单因素实验的结果：基质含水量为50%，后熟时间为20 h，选取接种量(A)、发酵温度(B)、发酵时间(C)对纳豆激酶活性影响较大的因素作为考察因素，以纳豆激酶活性(Y)为评价指标，对鹰嘴豆的发酵工艺条件进行响应面分析，具体实验方案见表1。获得多元二次项回归方程为：Y=977.9+16.06A-4.64B-1.25C+8.55AB+8.46AC+1.95BC-211.31A2-91.63B2-15.43C2。

表1 响应面优化实验方案及结果Table 1 Design and results of response surface experiments

表2 响应面实验结果方差分析Table 2 Variance analysis of response surface experimental results

图7 发酵温度、发酵时间和接种量的 交互作用对NK活性影响的响应面图Fig.7 Response surface diagram of the effect of fermentation temperature, fermentation time and inoculation amount on NK activity

由图7可知，发酵温度和接种量、发酵时间和接种量、发酵时间和发酵温度之间都有一定的交互作用，最佳预测点在实验考察范围内。因此，该二阶模型具有良好的拟合度，能真实描述各因素与响应值之间的关系。接种量、发酵温度、发酵时间与鹰嘴豆纳豆的NK活性有显著的相关性，表现为曲面较陡，其中接种量对鹰嘴豆纳豆的NK活性影响最大。结合等高线的疏密程度可知，接种量与发酵温度的交互作用影响更显著，接种量与发酵时间、发酵温度与发酵时间两两之间有一定的交互作用，但交互作用的影响不如接种量与发酵温度的交互作用影响显著。

根据建立的数学模型进行参数的最优分析，得到鹰嘴豆发酵的最佳工艺条件：接种量为6.04%，发酵温度为33.98 ℃，发酵时间为47.61 h，模型预测纳豆激酶活性为978.274 IU/g。考虑实际操作中的条件限制，将工艺条件调整为接种量6%，发酵温度34 ℃，发酵时间48 h。为增加可信度，在最佳工艺条件下进行3次平行发酵实验，得到纳豆激酶活性平均值为986.324 IU/g，与理论预测值接近。表明该模型准确可靠，利用该模型在鹰嘴豆纳豆生产实践中是可行的。

3 结论

在单因素实验结果的基础上，采用响应面法优化了鹰嘴豆发酵纳豆的工艺。以接种量、发酵温度、发酵时间3个因素作为自变量做3水平3因素的Box-Behnken实验，得到因素与响应值之间的拟合方程为Y=977.9+16.06A-4.64B-1.25C+8.55AB+8.46AC+1.95BC-211.31A2-91.63B2-15.43C2。获得鹰嘴豆发酵纳豆的最佳工艺参数为：接种量6%，发酵温度34 ℃，发酵时间48 h，在此条件下纳豆激酶活性高达986.324 IU/g，为研发优质纳豆食品、提高纳豆中的纳豆激酶活性提供了实验数据和技术参考。