多金属氧酸盐/壳聚糖磁性复合材料的制备及其用于磷酸化肽的富集

江丹丹, 马玖彤, 贾 琼

(吉林大学化学学院, 吉林 长春 130012)

蛋白质磷酸化是最重要和最普遍的翻译后修饰之一,在细胞增殖、代谢、分化、转录和信号转导等许多过程中起着重要的调节作用[1]。蛋白质磷酸化的测定对于全面了解生物过程中的磷酸化途径至关重要。目前,质谱技术已成为分析蛋白质磷酸化的重要手段。然而,由于磷酸化肽固有的低丰度和低电离效率,以及非磷酸化肽共存所造成的严重抑制,使得直接质谱分析仍然是一个挑战[2]。因此,在质谱分析之前应首先对磷酸化肽进行富集[3,4]。

金属氧化物亲和色谱(MOAC)是磷酸化蛋白质组学中常用的一种富集技术[5],其中金属氧化物由于存在两性表面而与磷酸酯基团产生很强的可逆结合力。常用的金属氧化物一般为二氧化钛(TiO2)、二氧化锆(ZrO2)、五氧化二铌(Nb2O5)和五氧化二钽(Ta2O5)等价态较高的金属氧化物[6,7]。近年来,基于多金属氧酸盐(POM)的磁性材料在蛋白质吸附方面显示出了潜在的应用前景[8]。POM是过渡金属离子的高氧化态(如钒(V)、钼(Mo)、钨(W)等)与氧形成的纳米级金属-氧簇类化合物,由于其独特的纳米分子结构和广泛的物理和化学性质,引起了人们极大的兴趣[9]。POM具有金属氧化物表面的显著特征和丰富的化学位点,适合作为光电材料、催化剂和吸附剂[10]。

本工作提出了一种基于POM磁性纳米粒子(MNPs)材料富集磷酸化肽的方法[11,12]。首先,制备半胱胺修饰的壳聚糖(CYECS)[13],以提高壳聚糖(CS)的正电性和溶解性,进而采用层层自组装技术[14]制备POM/CYECS磁性材料,结合基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测手段,用于对磷酸化肽的富集。这种POM/CYECS磁性材料结合了磁响应快速、亲水性、正电性和金属氧化物表面大等优点,对磷酸化肽具有高富集选择性。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Nicolet is5型傅里叶变换红外光谱仪(FT-IR, Thermo Nicolet公司,美国); X射线光电子能谱仪(XPS, Thermo Electron公司,美国); X射线衍射仪(XRD, PANalytical公司,荷兰); 5800基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪(Applied Biosystems 公司，美国); KQ2200DB型数控超声清洗器(湖南长沙超声仪器有限公司); JJ-1型磁力搅拌器(江苏江南仪器厂)。

钨酸钠二水合物(Na2WO4·2H2O)、氯化钆六水合物(GdCl3·6H2O)、三氟乙酸(TFA)、硅酸四乙酯(TEOS)、3-(甲基丙烯酸酰氧)丙基三甲氧基硅烷(APTES)、水合肼(N2H4·H2O)和乙腈(ACN)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司);三氯化铁六水合物(FeCl3·6H2O)、醋酸钠(NaAc)、氨水(NH3·H2O)、碳酸氢铵(NH4HCO3)、氢氧化钾(KOH)、醋酸(HAc)、壳聚糖(CS)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、N-邻苯二甲酸酐(N-Phth)、环氧氯丙烷(EN)、异丙醇(IPA)、三乙胺(TEA)、戊二醛(GA)、半胱胺盐酸盐(CYE)、乙二醇、甲酸、乙醇和甲醇(北京化学试剂公司);胰蛋白酶、β-酪蛋白、牛血清蛋白、卵清蛋白(Sigma Aldrich公司,美国)。

1.2 MNPs-(POM/CYECS)的合成

准确称取1.037 5 g Na2WO4·2H2O,分散到20 mL水中,调节溶液pH至7.5。随后加入0.12 g GdCl3·6H2O,搅拌条件下加热至85 ℃,得到Gd-POM固体。

称取0.34 g CS和0.83 gN-Phth,溶解至6 mL DMF中,在氮气氛围下搅拌加热至120 ℃,保持8 h。最后倾入冰水,得到灰褐色固体,即N-邻苯二甲酸酐保护壳聚糖(N-PhthCS)。

称取0.34 gN-PhthCS和0.52 g EN,溶解至10 mL DMF中,搅拌加热至60 ℃,保持0.5 h。然后加入IPA和KOH继续搅拌12 h,得到环氧基功能化N-保护壳聚糖(ENCS)。

称取0.3 g ENCS和0.6 g CYE,溶解至10 mL DMF中,搅拌条件下加热至25 ℃,保持1 h,再加入4 mL TEA，继续搅拌8 h。将得到的产物用大量甲醇清洗,重新分散至20 mL N2H4·H2O中,搅拌加热至60 ℃,保持6 h,得到CYECS,最后于60 ℃真空干燥。

称取1.35 g FeCl3·6H2O,溶于75 mL乙二醇中,加入3.60 g NaAc,搅拌形成均匀的黄色黏稠溶液,将该溶液转移至高压不锈钢反应釜中,在烘箱中于200 ℃加热12 h,用乙醇和水冲洗3次,在外界磁铁的帮助下分离产物,得到Fe3O4纳米粒子。

将350 mg Fe3O4纳米粒子分散于220 mL乙醇、55 mL水和1.4 mL 25%(v/v) NH3·H2O中,超声处理分散15 min,加入1 mL TEOS,在室温下搅拌10 h,得到Fe3O4@SiO2。

将100 mg Fe3O4@SiO2分散至30 mL乙醇中,加入1.3 mL APTES,搅拌加热至25 ℃,保持1 h,用乙醇冲洗3次,在外界磁铁的帮助下分离产物,得到MNPs-NH2纳米粒子。

将MNPs-NH2纳米粒子分散至30 mL 3 mg/mL Gd-POM甲醇溶液中,搅拌加热至50 ℃,保持3 h,得到MNPs-POM1。将MNPs-POM1分散至30 mL 3 mg/mL醋酸溶液中,然后加入GA,搅拌加热至50 ℃,并保持1 h,得到MNPs-(POM1/CYECS1)。重复上述自组装过程4次,得到多层修饰的MNPs-(POM/CYECS)产物。

1.3 样品前处理

称取1 mgβ-酪蛋白样品,溶解于1 mL 50 mmol/mL碳酸氢铵溶液中,于100 ℃加热变性10 min,冷却至室温,加入20 μL 1 mg/mL胰蛋白酶,于37 ℃水浴条件下酶解16 h,然后在室温下加入2 μL甲酸终止反应。酶解液置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.4 磷酸化肽的富集过程

将0.5 mg MNPs-(POM/CYECS)加入到100 μL含有肽的缓冲水溶液(50%( v/v)ACN和0.1%(v/v)TFA)中,超声处理30 min,在外界磁铁的帮助下分离MNPs-(POM/CYECS)。去除上清液后,用100 μL缓冲溶液洗涤3次。然后用30 μL 5% (v/v)NH3·H2O超声处理10 min以洗脱捕获的磷酸化肽,将得到的洗脱液进行质谱分析。

1.5 MALDI-TOF质谱条件

离子源:电喷雾电离源,正离子模式(ESI+);离子源温度:110 ℃;电喷雾电压:2.3 kV;扫描范围:m/z1 000～3 500;毛细管电压:3 500 V;碰撞解离能量:10 eV;去溶剂气体:氮气;去溶剂温度:200 ℃;去溶剂气体流速:8 L/min。

2 结果与讨论

2.1 MNPs-(POM/CYECS)的表征

2.1.1CYECS的表征

图1为CYECS制备过程的示意图。本实验首先合成N-PhthCS和ENCS,并用红外光谱对CS、N-PhthCS、ENCS和CYECS进行了表征。结果表明,N-PhthCS和ENCS具有CS的所有特征峰;N-PhthCS在1 715 cm-1和1 770 cm-1处出现了吸收峰,可以归因于C=O的振动,证实了N-Phth的成功引入;ENCS在1275 cm-1处的峰为C-O-C的振动峰;与ENCS相比,CYECS光谱中C=O的振动强度降低。这些结果表明已成功合成了CYECS。另外,对产物进行了元素分析,结果表明，CYECS中C、H、N和S的含量分别为47.48%、6.72%、5.95%和3.89%。

2.1.2Gd-POM的表征

已有文献[15]报道钆氧化物对磷酸化肽具有很好的富集效果,因此本工作选用了Gd-POM,并用FT-IR表征Gd-POM的结构特征。在755、850和940 cm-1处分别出现了吸收峰,与文献[16]报道一致。另外,用XPS对Gd-POM的元素组成进行表征,W 4f、Gd 4d、Gd 3d、O 1s和Na 1s的峰值分别对应35.4、141.6、418.4、530.6和1072.2 eV,表明Gd-POM被成功合成。

2.1.3MNPs-(POM/CYECS)的表征

CYECS和Gd-POM经层层自组装后制备得到MNPs-(POM/CYECS)磁性材料。用XPS对MNPs进行表征,在MNPs的谱图中,出现了Fe 2p(711.04 eV)和O 1s(532.89 eV)峰,而在MNPs-(POM/CYECS)的谱图中还出现了W 4f、Si 2p、Gd 4d、C 1s、N 1s和Na 1s峰,表明POM/CYECS壳被成功封装在MNPs表面上。实验还采用XRD对MNPs-(POM/CYECS)进行表征,在MNPs-(POM/CYECS)的谱图中出现了30.27°、35.66°、43.30°、53.58°、57.21°、62.78°的2θ衍射峰,与MNPs的衍射峰吻合,说明MNPs的晶体结构在制备过程中没有被破坏。

2.2 MNPs-(POM/CYECS)对磷酸化肽的富集

实验考察了MNPs-(POM/CYECS)对β-酪蛋白酶解液中磷酸化肽的富集性能。首先研究和优化了富集和解吸条件,确定含50%(v/v) ACN和0.1%(v/v)TFA的水溶液为缓冲溶液，5%(v/v)NH3·H2O为解吸液。在此条件下,比较了富集前和经过MNPs-(POM/CYECS)富集后的磷酸化肽的质谱图(见图2)。通过直接分析,大量的非磷酸化肽信号出现在质谱图中(见图2a)。经MNPs-(POM/CYECS)富集后,非磷酸化肽的信号显著降低,可以明显观察到磷酸化肽的信号(见图2b)。富集到的磷酸化肽的详细序列信息见表1。结果表明,本工作制备的磁性材料能够有效捕获磷酸化肽。相比之下,单独的钆酸盐材料由于具有负电性,不利于同样带负电的磷酸化肽的吸附[17]。另外,与其他基于壳聚糖的磁性材料相比,本实验制备的磁性材料对磷酸化肽具有更高的选择性和灵敏度[18,19]。

图 1 CYECS的合成路线Fig. 1 Synthetic scheme of cysteamine hydrochloride-modified chitosan (CYECS)CS: chitosan; N-PhthCS: phthalic anhydride modified chitosan; ENCS: epichlorohydrin modified chitosan.

图 2 β-酪蛋白酶解液(4 pmol)经MNPs-(POM/CYECS)富集(a)前、(b)后的MALDI-TOF质谱图Fig. 2 MALDI-TOF mass spectra of β-casein digests (4 pmol) (a) before and (b) after enrichment with polyoxometalate-CYECS magnetic nanoparticles (MNPs-(POM/CYECS)) # Dephosphorylated fragments. Peaks 1-10 indicated phosphopeptides that could be seen in Table 1.

由于复杂生物样品中磷酸化肽的浓度较低,因此要求方法具有较高的检测灵敏度。为了评价本实验设计基于MNPs-(POM/CYECS)富集的MALDI-TOF MS方法的灵敏度,分别选取20、2、0.2和0.02 fmol的β-酪蛋白的胰蛋白酶解液作为检测样品。结果表明,当β-酪蛋白的浓度为0.02 fmol时,仍可以观察到具有较强信号的磷酸化肽。说明检出限低至0.02 fmol,证明本实验方法具有较高灵敏度。

实验还考察了MNPs-(POM/CYECS)的使用重复性。以β-酪蛋白的胰蛋白酶解液作为检测样品,使用MNPs-(POM/CYECS)20次后，富集后得到磷酸化肽的信号强度和第1次使用后得到的几乎无差别(见图3),表明该磁性材料具有很好的使用重复性。

表1β-酪蛋白酶解液经MNPs-(POM/CYECS)富集得到的磷酸化肽序列信息

Table1Informationoftheenrichedphosphopeptidesfromβ-caseindigestswithMNPs-(POM/CYECS)

No.Observed m/zNumber of phosphorylation sitePeptide sequence11030.51FQ[pS]EEQQQTEDELQDK21155.62[pS][pS]EEKFLR31253.11TVD[Mo]ME[pS]TEVF41466.21TVDME[pS]TEVFTK51561.54RELEELNVPGEIVESL[pS][pS][pS]EE[pS]ITR61943.12DIG[pS]E[pS]TEDQA[Mo]EDIK72061.91FQ[pS]EEQQQTEDELQDK82556.11FQ[pS]EEQQQTEDELQDKIHPF92966.24ELEELNVPGEIVE[pS]L[pS][pS][pS]EESITR103122.14RELEELNVPGEIVE[pS]L[pS][pS][pS]EESITR

Nos. 1-10 were the same as that in Fig. 2.

图 3 β-酪蛋白酶解液(4 pmol)经MNPs-(POM/CYECS)富集后的MALDI-TOF质谱图Fig. 3 MALDI-TOF mass spectra of β-casein digests (4 pmol) after enrichment with MNPs-(POM/CYECS) Peaks 1-10 and # were the same as that in Fig. 1.

为了考察MNPs-(POM/CYECS)对磷酸化肽的富集选择性,选取β-酪蛋白、牛血清白蛋白和卵清蛋白的混合物(物质的量之比1∶2 000∶2 000)作为分析物。通过直接分析,没有观察到磷酸化肽的质谱峰。然而,经MNPs-(POM/CYECS)富集后,质谱图中出现了10条磷酸化肽的信号,证明了此磁性材料对磷酸化肽的高选择性富集性能。将本工作与最近报道的磁性材料进行比较,结果见表2,说明本实验制备的磁性材料对磷酸化肽具有令人满意的选择性及灵敏度。

表 2 本工作与其他报道的材料的磷酸化肽富集效果的比较Table 2 Comparison of enrichment efficiency of the other materials for phosphopeptides with reported materials

MG@mSiO2-ATP-Ti4+: adenosine phosphate-Ti4+functionalized magnetic mesoporous graphene oxide nanocomposite; Fe3O4@SiO2@(HA/CS)10-Ti4+: titanium phosphate moiety on a multilayer polysaccharide (hyaluronate and chitosan) coated Fe3O4@SiO2nanoparticle; mag GO-CS-Ti4+: Ti4+ions immobilization on crosslinked chitosan loaded on the surface of magnetic graphene oxide; Fe3O4@MIL-101(Fe): metal-organic frameworks shell onto Fe3O4nanoparticles; DFMMOF: dual-metal centered zirconium-organic framework; Fe3O4/PDA/PAMA-Arg: Fe3O4/polydopamine/poly(2-aminoethyl methacrylate hydrochloride)/arginine; BSA: bovine serum albumin.

3 结论

本文通过层层自组装技术制备了多金属氧酸盐-壳聚糖复合吸附磁性材料,结合MALDI-TOF MS检测手段,成功用于磷酸化肽的富集。该磁性材料具有快速磁响应、亲水性、正电性的特点,增强了对磷酸化肽的富集效率和选择性。本工作不仅提供了一种新型高效富集磷酸化肽的磁性材料,还进一步开拓了多金属氧酸盐的应用领域。