离子色谱-脉冲安培法测定芦荟多糖中7种单糖的含量

2019-03-08乐胜锋王雅萱赵新颖

色谱 2019年3期

乐胜锋, 王尉, 王雅萱, 赵新颖

(北京市理化分析测试中心, 有机材料检测技术与质量评价北京市重点实验室, 北京 100094)

芦荟是一种极具药用价值和经济价值的植物,其多糖成分具有抗肿瘤、抗辐射、抗病毒等作用[1-3]。由于品种、种植条件、提取方式不同,芦荟多糖的组成和含量也有很大差异。因此,建立一种快速、准确测定芦荟多糖含量和组成的方法,可以满足芦荟多糖功能研究和质量监控的需求,促进芦荟经济效益的开发。然而,多糖一般由单糖通过糖苷键聚合而成,结构复杂、种类繁多,聚合度差异很大,标准样品少,直接测定多糖含量难度很大。目前普遍采用的方法是将多糖水解为单糖,再利用气相色谱[4,5]和液相色谱[6-8]等方法测定单糖的含量,从而得到多糖的组成和含量。单糖不易挥发且基本没有紫外或荧光吸收[9,10],利用气相色谱法检测,需要将单糖衍生为易挥发物质;利用液相色谱法检测,则需要将单糖衍生为具有紫外或者荧光吸收的物质。衍生过程操作繁琐,结果误差较大。液相色谱-质谱法[11,12]灵敏度高且不需衍生,但存在色谱柱失效快、检测干扰大的问题。离子色谱-脉冲安培法(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector, HPAEC-PAD)是近年发展起来的一种糖类物质分析方法[13-18],单糖经高效阴离子交换色谱柱分离后在安培检测器的金电极表面发生氧化反应,引起电流变化而被检测,避免了衍生过程。该方法具有选择性好、灵敏度和准确度高的优势[19-21],可以用于半乳糖、葡萄糖、甘露糖等单糖的测定[22-25]。目前,尚未见利用该法同时测定芦荟多糖中岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖的报道。

本文优化了芦荟多糖的三氟乙酸水解条件和离子色谱分离条件,建立了基于CarboPac PA10色谱柱同时测定芦荟多糖水解产物中常见7种单糖(图1)的HPAEC-PAD法,克服了鼠李糖与阿拉伯糖、甘露糖与木糖分离度低的困难,提高了结果的准确性。

图 1 7种单糖的结构式Fig. 1 Chemical structures of seven monosaccharides

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

ICS5000型离子色谱仪,配有安培检测器,Chromeleon 6.8色谱工作站,Dionex CarboPac PA20色谱柱(150 mm×3 mm, 6.5 μm), CarboPac PG20保护柱(30 mm×3 mm, 6.5 μm), Dionex CarboPac PA10色谱柱(250 mm×4 mm, 10 μm)和CarboPac PG10保护柱(50 mm×4 mm, 10 μm)(美国Thermo Fisher Scientific公司); Milli-Q Integral 3超纯水系统(美国Millipore公司); XS205电子天平(d=0.01 mg,瑞士Mettler Toledo公司); Reference 2可调量程移液器(200 μL、1 000 μL,德国Eppendorf公司)。

岩藻糖(纯度>98%)、阿拉伯糖(纯度>99%)、半乳糖(纯度>99%)、甘露糖(纯度>99%)和木糖(纯度>99%)均购自阿拉丁试剂(上海)有限公司。鼠李糖(纯度>98%)购自中国食品药品检定研究院。葡萄糖(纯度>99%)购自Sigma试剂公司。三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA,纯度>99.%)购自酷尔化学试剂公司。醋酸钠(NaOAc,纯度>99.%)购自Sigma试剂公司。氢氧化钠(质量分数50%)购自Fisher Scientific公司。无水乙醇(纯度99.5%)购自北京化工厂。

实验用中华芦荟(学名:AloechinensisBaker)、木立芦荟(学名:AloearborescensMiller)、库拉索芦荟(学名:AloebarbadensisMiller)均购自花卉市场。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取对照品,用超纯水配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液,4 ℃保存,有效期1个月。分别移取各标准储备液于100 mL容量瓶中,超纯水定容,配制成不同浓度的混合标准工作溶液。

1.3 样品处理

取芦荟鲜叶,去皮,粉碎,称重。按照1 g∶20 mL加入超纯水,60 ℃水浴提取1 h,抽滤。按照提取液和乙醇体积比1∶4向滤液中加入乙醇,机械搅拌20 min,室温静置3～4 h,弃去上清液。无水乙醇洗涤沉淀两次,冷冻干燥得芦荟多糖样品,室温防潮保存。

取10 mg芦荟多糖样品于带盖样品瓶中,加入5 mL TFA水溶液(3 mol/L),充入氮气3 min, 100 ℃密闭水解3 h。移取2 mL溶液,50 ℃真空浓缩至干,甲醇洗涤3次,2 mL超纯水复溶,过0.22 μm膜过滤。根据标准曲线范围稀释至合适浓度,上机测定。

1.4 色谱条件

分离柱:Dionex CarboPac PA10;保护柱:CarboPac PG10;进样量:25 μL;流速:1.0 mL/min;柱温:30 ℃;检测模式:积分安培检测器,标准四电位,工作电极为Au;梯度洗脱程序:0～16 min, 20 mmol/L NaOH; 16.1～20 min, 20～14 mmol/L NaOH; 20～25 min, 14 mmol/L NaOH; 25.1～32 min, 50 mmol/L NaOH-400 mmol/L NaOAc; 32.1～35 min, 200 mmol/L NaOH; 35.1～45 min, 20 mmol/L NaOH。其中25 min到45 min为色谱柱清洗并重新平衡的过程。

2 结果与讨论

2.1 色谱柱的选择

实验考察了色谱柱、淋洗液梯度和分离温度对7种单糖分离的影响。比较了7种单糖在Dionex CarboPac PA10和Dionex CarboPac PA20上的分离情况。结果表明,改变淋洗梯度和分离温度,可以有效改变7种单糖的分离。在Dionex CarboPac PA20上,随着鼠李糖和阿拉伯糖分离度的增加,半乳糖、葡萄糖和甘露糖的分离度减小,7种单糖不能同时实现基线分离,尤其是半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖较为困难。柱容量较高的色谱分离柱和浓度较低的淋洗液均可以增加单糖的保留时间,有利于分离条件的优化。因此,选用Dionex CarboPac PA10并考察了0 min到25 min内6种梯度变化对半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖4种单糖分离效果的影响(见图2和图3)。结果表明,梯度1和梯度6均会造成甘露糖和木糖分离度小于0.64,过高的淋洗浓度和过低的淋洗浓度均不适合甘露糖和木糖的分离。将淋洗梯度变化区间延后,以增加淋洗梯度变化对上述4种单糖分离的影响程度,如梯度2～5。梯度2中半乳糖、葡萄糖、甘露糖三者实现了良好的分离,但甘露糖和木糖的分离度只有0.71,其色谱峰峰宽分别为1.62 min和1.44 min,峰形较差。梯度5中各单糖分离效果最佳,半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖之间的分离度分别为1.4、1.5、0.9,虽然甘露糖和木糖仍不能实现基线分离,但甘露糖和木糖的峰宽分别为0.82 min和0.83 min,峰形最优。因此,采用梯度淋洗条件(0～16.0 min 20 mmol/L NaOH; 16.1～20.0 min 20～14 mmol/L NaOH; 20.0～25.0 min 14 mmol/L NaOH),可以使7种单糖得到较好的分离(见图4)。

图 2 分离7种单糖的6种梯度洗脱程序Fig. 2 Six gradient programs for the separation of the seven monosaccharides

图 3 梯度淋洗对4种单糖分离度的影响Fig. 3 Effect of gradient elution programs on the resolution of the four monosaccharides

图 4 7种单糖混合标准溶液的离子色谱图Fig. 4 Ion chromatogram of the mixed standard solutions of the seven monosaccharides

2.2 水解条件的优化

三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA)在80～120 ℃条件下可以破坏糖苷键,使多糖降解为单糖。同时,TFA易挥发,水解后容易去除,是最为常用的多糖水解试剂[26,27]。以中华芦荟多糖为实验对象,考察了TFA的浓度、温度和时间的影响。

2.2.1TFA用量

芦荟多糖水解过程总体积为5 mL,考察了TFA使用量为5、15和25 mmol时在80 ℃下水解7.5 h下的效果。结果表明,5 mmol TFA时,多糖只能水解出少量的岩藻糖和甘露糖,不能检出其他5种单糖。15 mmol和25 mmol TFA时,多糖水解均可以得到7种单糖。但只有半乳糖和葡萄糖的含量随着TFA使用量增加略有升高,其他5种多糖均出现了降低。这是因为TFA浓度过低时,多糖水解不完全,不能释放出全部单糖分子;浓度过高时,水解产生的单糖又会发生过度水解,导致含量减少[15](见图5)。因此,实验选择15 mmol TFA(3 mol/L)进行水解。

图 5 三氟乙酸使用量对单糖含量测定的影响Fig. 5 Effect of the TFA usage amount on the monosaccharide contents

2.2.2温度

在15 mmol TFA(3 mol/L)条件下,考察了多糖在80、100和120 ℃时水解7.5 h的效果。结果表明,随着温度的升高,水解产生的7种单糖含量出现先增高后减低的趋势,100 ℃下各种单糖含量最高(见图6)。这是因为温度较低通常导致水解反应不充分,而温度较高会使多糖碳化,不利于水解反应。因此,实验选择100 ℃水解。

图 6 温度对单糖含量测定的影响Fig. 6 Effect of temperature on the monosaccharide contents

2.2.3时间

在15 mmol TFA(3 mol/L)、100 ℃下考察了水解3、7.5、12 h的影响。结果显示,随着时间的延长,岩藻糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖的含量均有所降低,只有鼠李糖的含量稍有增加(见图7),这是因为水解时间过长可能会导致单糖过度水解。因此,实验选择水解时间为3 h。

图 7 水解时间对单糖含量测定的影响Fig. 7 Effect of hydrolysis time on the monosaccharide contents

2.3 方法的线性范围、定量限和精密度

在优化的色谱条件下,以单糖的峰面积(Y)对其质量浓度(X)进行线性回归,得到回归方程和相关系数。以信噪比(S/N)为10时的质量浓度为定量限。取同一浓度水平的供试品溶液测定6次并计算RSD,考察方法的精密度,结果见表1。

表 1 7种单糖的线性范围、回归方程、相关系数、定量限和精密度Table 1 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients, limits of quantification (LOQs) and precisions of the seven monosaccharides

Y: peak area;X: mass concentration, mg/L.

2.4 加标回收率

中华芦荟样品按照1.3节所示步骤处理,按照1.4节所示条件进行测定,得到样品的含量。在此基础上进行加标回收试验,每个浓度平行测定6次。结果显示,7种单糖的回收率在97.5%～102.5%之间,相对标准偏差小于5%(见表2),满足方法学定量要求。

表 2 7种单糖在实际样品中的加标回收率及RSD(n=6)Table 2 Spiked recoveries and RSDs of the seven monosaccharides in samples (n=6)

图 8 3种芦荟中7种单糖对比的色谱图Fig. 8 Comparison of the seven monosaccharides from three species of aloe polysaccharides

2.5 样品测定

取中华芦荟、木立芦荟和库拉索芦荟样品,分别按照1.3节步骤处理,1.4节条件进行测定。结果表明,中华芦荟、木立芦荟和库拉索芦荟多糖都含有以上7种单糖(见图8),含量见图9。从图9可以看出,中华芦荟和库拉索芦荟中7种单糖的含量按照甘露糖、半乳糖、葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖、岩藻糖依次降低,且中华芦荟中的每种多糖除木糖外均高于库拉索芦荟。因此,中华芦荟中的多糖优于库拉索芦荟。木立芦荟中7种单糖的含量按照半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、鼠李糖、岩藻糖依次降低,其木糖含量在3种多糖中最高。计算得到中华芦荟、木立芦荟和库拉索芦荟多糖中岩藻糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、甘露糖和木糖7种单糖成分的物质的量比分别为1∶1.4∶5.5∶16.4∶8.1∶79.4∶1.8、1∶1.6∶7.0∶25.2∶6.8∶17.3∶15.2和1∶1.4∶5.4∶13.3∶5.0∶54.0∶2.2。