生物样品中神经递质的定量测定及其应用研究进展

曹雨虹, 张明勇, 刘 敏, 洪战英*

(1. 第二军医大学药学院药物分析学教研室, 上海市药物(中药)代谢产物研究重点实验室, 上海 200433;2. 第二军医大学长海医院药学部, 上海 200433)

在神经分支的发生和生长以及神经交流/神经电路的发展中,脑神经传递是一个重要的过程[1]。神经递质(neurotransmitters, NTs)是能够促进神经传递的内源性化学信使,在许多大脑功能中发挥重要作用,包括行为和认知。它们影响并且调整肌肉张力和心率,调节学习、睡眠、记忆、意识、情绪和食欲。在正常的生理条件下,神经递质在细胞中形成神经网络控制着突触功能。神经递质通常储存在突触小泡中,并通过适当的信号释放到突触中,释放的神经递质通过突触间隙建立连接并与相应受体结合,完成突触传递。

中枢神经系统中神经递质浓度的变化与许多精神和生理疾病有关,例如阿尔茨海默症(Alzheimer disease, AD)、帕金森氏症、精神分裂症、癫痫、心律失常、甲状腺激素缺乏症、充血性心力衰竭等,因此神经递质浓度的检测是研究这些疾病的一个重要手段。神经递质在生物样品中的含量很低,且本身荧光响应和质谱响应信号不强,而生物样品本身基体复杂,内源性干扰物质较多,因此NTs的分析检测存在极大困难。建立快速高效的样品前处理方法和灵敏的检测手段仍是目前深入开展神经递质研究需要解决的问题。本文对一些常见的神经递质,如多巴胺(dopamine, DA)、乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)、氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid, GABA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine, 5-HT)、肾上腺素(epinephrine, EP)和去甲肾上腺素(noradrenalin, NE)、谷氨酸(Glu)、天冬氨酸(Asp)等的定量检测方法以及在一些疾病研究中的应用现状进行综述(见图1)。

图 1 神经递质常见的检测方法及其在不同疾病中的应用Fig. 1 Common detection methods of neurotransmitters (NTs) and their applications in different diseasesACh: acetylcholine; 5-HT: 5-hydroxytryptamine; DA: dopamine; GABA: gamma-aminobutyric acid; NE: noradrenalin.

1 神经递质及其与疾病的关系

神经递质可分为生物胺类、氨基酸类、ACh类等,通过突触间隙建立连接并与相应受体结合,完成突触传递。到目前为止,已经鉴定了100多种神经递质。

单胺类神经递质是功能重要的脑神经递质,由儿茶酚胺(DA、NE和EP)和5-HT组成。DA和5-HT在大脑中起关键作用,控制运动、情绪和行为[2]。DA神经元主要位于中脑黑质致密部位,中脑腹侧被盖区域和下丘脑[3]。5-HT在呼吸、体温和情绪的自主控制中也被认为起着重要作用[4]。

ACh是1921年发现的第一个神经递质[5],分布于神经肌肉接头、脑、脊髓和自主神经系统中。ACh在记忆与学习中起着关键作用,同时还起着调节皮质结构、脑血液动态和睡眠周期的作用。有文献[6]报道乙酰胆碱神经元与AD的发病机制有关。

Glu是大脑中枢神经系统(CNS)中的主要兴奋性神经递质。Glu在突触传递,组织和与疾病相关的神经元迁移中起关键作用[7]。除了在CNS中的重要生理功能外,Glu还在许多疾病(诸如癫痫、神经变性疾病和中风)的病理生理学中起关键作用[8]。Glu的过量释放导致突触后膜Glu受体过度被激活,引起神经功能障碍和变性,在一定程度上会产生神经兴奋性毒性,进而引发脑缺血损伤。

GABA是成熟CNS中的主要抑制性神经递质。它通过控制中间神经元的活动模式来调节神经网络的动态。GABA在调节脑修复中起重要作用[9],在早期脑缺血和再灌注期间,GABA神经传递的丧失会导致持续的神经元兴奋性并可能导致神经元死亡[10]。

2 神经递质的定量检测方法

针对神经递质检测已报道的方法可总结为仪器分析方法、电化学传感器、新兴材料检测法3大类。在神经递质检测中使用较为广泛的仪器分析法,主要包括高效液相色谱(HPLC)法、高效毛细管电泳(HPCE)法、气相色谱-质谱联用(GC-MS)法以及液相色谱-质谱联用(LC-MS)法等。

2.1 HPLC法

HPLC法是应用较为广泛的定量分析方法,具有良好的选择性和较低的检出限。HPLC法应用于神经递质检测时所采用的检测器有紫外-可见光(ultraviolet-visible, UV-VIS)检测器、荧光(fluorescence, FL)检测器和电化学检测器(electrochemical detection, ECD)。多数神经递质荧光基团和可供离子化的官能团不多,对荧光和质谱的响应信号较弱,且生物样品基质复杂,内源性干扰物质多,因此采用紫外可见光或荧光检测器、衍生化(分离前或分离后)常常是必要的。ECD由于检测灵敏度高、操作简单,且对于儿茶酚胺和吲哚胺类化合物的检测无需衍生化,应用日益广泛。ECD检测可以通过库仑法或安培法进行,库仑法具有较低的检出限。

Chen等[11]选用邻苯二甲醛作为衍生化试剂,采用HPLC-库仑法结合微透析技术检测大脑中5种氨基酸类神经递质的含量。该方法检出限可达1.5～5.7 nmol/L,可用于体内神经递质的连续监测。Sanli等[12]采用3(4-羧基苯甲酰基)-2-喹啉环甲醛为衍生试剂,建立了RPLC-FL方法检测大鼠和小鼠脊髓组织中4种氨基酸类神经递质:Glu、甘氨酸(Gly)、牛磺酸(Tau)和GABA,由于大多数氨基酸的发光强度较弱,采用柱前衍生法进行荧光检测提高了重现性和灵敏度。同时柱前衍生化增加了分析物的疏水性,使其足以保留在反相固定相上。在最佳条件下,对于所有分析物,在0.50～50.00 mol/L的浓度范围内,线性相关系数为0.991 2至0.999 7,检出限范围为0.03～0.06 mol/L。

2.2 HPCE法

HPCE具有进样量小(最低可达nL级)、分析时间短和柱效高的特点,常与微透析技术和在线柱前衍生技术联用,在体内氨基酸类神经递质的分析和连续监测方面具有明显的优势[13]。大脑微透析、毛细管电泳(CE)与激光诱导荧光检测的联合使用,对神经递质的外排物可以做到以每10 s一次的同步监测。激光诱导荧光检测技术相较于传统的荧光检测技术与毛细管电泳联用可达到更低的检出限。

Jako等[14]采用氟代试剂(7-氟-4-硝基-1,1,3-苯并恶二唑)为衍生化试剂,毛细管电泳与激光诱导荧光(LIF)联用技术检测生物样品中D-丝氨酸(D-Ser)、D-天冬氨酸(D-Asp)与Glu和Asp。D-Ser与D-Asp的定量限为0.05 μmol,该方法成功应用于成年小鼠的不同脑区中D-Asp和D-Ser含量检测。Lorenzo等[15]建立了简单、快速的CE-LIF检测方法,用来检测尿液、海马体组织样品中多种氨基酸的含量。该方法采用4-氟-7-硝基2,1,3-苯并恶二唑(NBD-F)为衍生化试剂,并且只需10 μL尿液或20 mg海马组织,衍生化时间为15 min,分析时间为20 min,灵敏度可达nmol级。该方法成功应用于检测糖尿病患者尿液中Glu、Gly、D-Ser、Tau、Asp、苯丙氨酸(Phe)和Ser 7种氨基酸含量。Li等[16]采用脑微透析技术获得下丘脑细胞外液透析液,建立了同时测定多种氨基酸类神经递质的HPCE方法。该方法采用异硫氰酸荧光素为衍生剂,为了达到最佳分离状态,上样缓冲液中加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS)和3种有机改性剂(甲醇、乙腈和异丙醇),同时测定丘脑细胞外液透析液中多种氨基酸类神经递质含量,研究了脑缺血/再灌注过程中神经递质和神经调节剂的动态变化。

2.3 GC-MS法

GC-MS法也可用于神经递质的定量检测,与LC相比,GC通常具有更高的峰容量、更少的基质效应、更高的稳定性和灵敏度。质谱具有高选择性、高灵敏度以及结构判定等优势。目前GC-MS法应用于检测神经递质时同样需要样品纯化处理和衍生化。Aragon等[17]采用GC-MS法测定暴露于低浓度具有神经毒性农药和甲基汞等化学物质中的斑马鱼幼鱼中单胺类神经递质(MNT)的含量变化。该方法在样品前处理时采用两步衍生化:N-甲基-2-七氟丁胺(BMHFBA)用于N-全氟酰化反应;六甲基二硅氮烷(HDMS)用于O-硅烷化反应。方法的检出限和定量限分别为0.4～0.8 μg/L和1.2～2.7 μg/L。虽然未检测到视觉畸形,但在斑马鱼早期发育过程中MNT水平变化显著。结果表明,产生神经毒性的化学物质可以改变神经递质水平,从而可能影响早期脑发育。

2.4 LC-MS法

LC-MS法将色谱的高分离性能和质谱鉴别力强的特点相结合,许多剂量小药效强的药物及其代谢产物多为极性强、难挥发的化合物,LC-MS法弥补了传统液相检测器的不足,成为了体内药物分析中不可或缺的有效检测手段。近年来,LC-MS检测神经递质的应用日渐增多,表1列举了一些实例,包括样品前处理方法及其相应检出限等。

表 1 LC-MS测定生物样品中神经递质含量Table 1 Determination of NT contents in biological samples by LC-MS

DLLME: dispersive liquid-liquid microextraction; ILUSA: ionic liquid based ultrasound assisted; SCX/SPE: strong cation exchange/solid phase extraction; LLME: liquid-liquid microextraction; LLOQ: lower limit of quantitation; CNS: central nervous system.

由于生物样本中(包括血浆、尿液和脑组织等)神经递质的含量较低且内源性化合物干扰较大,采用LC-MS法检测时样品前处理是有必要的。传统的前处理技术包括液液萃取(liquid-liquid extraction, LLE)和固相萃取(solid phase extraction, SPE)。近年来,出现一些新的微萃取技术,包括填充吸着剂微萃取(microextraction by packed sorbent, MEPS)[32]、固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)[33]、分散液-液微萃取(dispersive liquid-liquid microextraction, DLLME)。DLLME是基于合理的萃取溶剂和分散溶剂混合物开发的萃取技术,只需要少量的有机溶剂,当快速注入液体样品后形成浑浊溶液并且样品和萃取溶剂之间快速达到平衡,而完成目标化合物的萃取。SPME是一种多用途的提取方法,需要非常少的溶剂量便可达到同时萃取和富集多种分析物的作用。然而,SPME纤维寿命是有限的。MEPS是一种用于样品纯化的小型化固相萃取技术,但与一般SPE有显著差异,它是把吸着剂直接集成到注射器中,而不是一个单独的小柱子,因此可用于100次以上的萃取纯化,而常规固相萃取小柱只能使用1次。MEPS可以与GC-MS、LC-MS、毛细管电色谱-质谱联用。用注射器作为进样装置,可以实现自动化,包括样品处理、萃取和注射等步骤[34]。传统的前处理技术需要较长的处理时间和大量的有机溶剂,这些新技术具有效率高、操作简单快速和成本低的优点,已逐渐应用于生物样品神经递质测定的处理。

2.抓安全教育。对HSE工作遵循“安全第一、预防为主”的原则，安全工作经常抓、抓日常，积极宣贯落实《安全生产禁令》《员工守则》和岗位责任制，开展了“人人都是安全员”、排查身边的隐患、“我能安全”演讲、书法作品征集等活动；开办了“安全生产小课堂”，利用周一生产会的时机，集中20分钟的时间，分析案例，讲解注意事项、家庭生活安全常识、夏季防暑降温技巧等知识；在单元亲情提示牌、服务大厅等显著位置张贴、发放“安全防范温馨提示七字歌”等宣传品，提醒大家做好安全防范，提高了全员的安全意识。

Jha等[19]采用离子液体超声辅助分散液-液微萃取(IL-USA-DLLME)结合LC-MS法检测大鼠脑组织、血浆和细胞内15种神经递质的含量,该检测方法快速、灵敏、经济且无需衍生化。前处理过程中采用离子液体替代了传统的有毒溶剂作为提取溶剂,将萃取溶剂(1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸盐,BMIMPF6)和分散溶剂(乙腈)的混合物快速注射到样品基质中,涡流搅拌和超声,离心,萃取相在下层。实验过程中所需溶剂量少,分析时间快,从样品制备到仪器分析时间不超过15 min。该分析方法具有良好的选择性,成功应用到不同生物基质(大鼠脑组织、大鼠血浆和细胞样品)中神经递质含量的测定,检出限在大鼠脑组织中可达到0.021～0.912 μg/L,在大鼠血浆中可达到0.028～0.978 μg/L,在细胞样品中可达到0.025～0.945 μg/L。Zhang等[35]采用N-叔丁氧羰基-L-色氨酸-羟基琥珀酰亚胺酯(Boc-TRP)作为衍生化试剂同时测定大鼠大脑微透析样本的多种神经递质。在三重四极质谱分析中,衍生化产物中的叔丁氧基基团显示出独特的碎片化模型,极大地提高了特异性和敏感度。该研究建立的快速LC-MS定量分析法线性范围宽,相关系数大于0.990。在室温下,Boc-TRP衍生剂在磷酸根缓冲液(pH 7.4)中衍生速度较快,衍生的神经递质在HPLC中可快速分离。

单胺类神经递质为强极性物质,在反相色谱柱上保留极弱,且离子化效率低,质谱响应信号不强,降低了质谱检测的灵敏度。通过衍生化处理可以改善单胺类神经递质的色谱保留行为和离子化效率。二乙基可降低单胺类神经递质的极性,提高离子化效率。氨基酸类神经递质含有羧基、羟基、氨基等极性基团,采用LC-MS法检测时需要先对其衍生化以提高待测物的分离度和灵敏度。氨基酸类神经递质常用的衍生试剂有邻苯二甲醛(OPA)、丹酰氯(Dansyl-C)、异硫氰酸苯酯(PITC)、丙酸酐等。这些传统的衍生化试剂都有各自的缺点,如OPA不能和仲氨酸反应,与胱氨酸的衍生物产生的荧光强度较低且不稳定;Dansyl-C的衍生化时间较长,同时Dansyl-C及其衍生物容易见光分解。近年来新的衍生化试剂不断出现,如Zhao等[26]采用10-乙基-阿啶酮-3-磺酰氯(EASC)为衍生试剂,开发了同时测定多种单胺类神经递质和氨基酸类神经递质的LC-MS法;Zhao等[30]等采用衍生化试剂4-氯代羰基罗萨明(CCR)建立了LC-MS法测定大鼠尿液中氨基酸类和单胺类神经递质的含量。如何选择合适的衍生化试剂、简化衍生化步骤、提高衍生化效率、使衍生产物稳定且无相互干扰是LC-MS法应用于神经递质检测的关键。Zheng等[36]首次提出稳定同位素标记衍生化与超声辅助DLLME联用技术,采用LC-MS法同时测定单胺类神经递质(MANT)及其生物合成前体和相应代谢物。质谱敏化试剂d0-10-甲基-阿啶酮-2磺酰氯和d3-10-甲基-嘧啶-2-磺酰氯作为同位素探针来标记神经递质可降低质谱分析中的基质效应。该方法已成功应用于帕金森病模型和正常大鼠脑微透析液中神经递质含量的测定。

2.5 电化学传感器法

仪器分析方法通常需要昂贵的仪器设备,操作比较耗时。近年来,一些研究人员[37]使用独特的材料开发生物传感器,用于体内神经递质的检测。这些传感器具有出色的传感性能,如快速响应、简单的测量程序、高灵敏度和选择性。其中,电化学传感器具有较好的重复性、较高的准确性及较宽的线性响应范围,具有低检出限和实时测量的优点,可实现与临床诊断和疾病治疗相关分析物的快速、灵敏、选择性和低成本检测。

在众多基于电化学检测方法报道中,碳基电极的应用较为广泛,用于体内神经递质检测可提供较高的分辨率,碳基电极可分为玻碳电极(GCE)、石墨烯电极(GRE)、碳糊电极(CPE)等。GCE已用于多分析物检测,玻碳通常用作几种化学修饰电极的底物。石墨烯(Gr)是极薄的材料,比金刚石更柔韧、更硬,并且在室温下比其他材料导电更有效。Gr对某些物质具有优异的电子转移促进能力,对小分子具有优异的催化性能。CPE由美国著名电化学家Adams[38]于1958年推出,具有制备快速简便、成本低等优于其他电极的优点。碳糊材料已成为实验室用于制备各种电极、传感器和探测器的最流行的电极材料之一。Baluta等[39]基于石墨烯量子点(GQD)和漆酶修饰的GCE开发了一种有用的电化学传感方法用于检测EP。在优化的条件下,线性范围为1.0～1.2×10-4mol/L,检出限为83 nmol/L。Madhu等[40]使用SnO2纳米片修饰导电碳纱(CCY),用作DA的无标记检测。采用水热法将SnO2纳米结构固定在CCY表面。在最佳实验条件下测定DA,检出限为53 nmol/L,线性范围为0.01～150 mol/L。

此外,其他碳基材料如碳纳米管(CNT)[41]、碳纤维(carbon fiber)[42]、贵金属和金属氧化物纳米颗粒(NPs)[43]、离子液体(ILs)[44]、分子印迹聚合物(MIP)[45]等用于电极的修饰,以提高神经递质检测的灵敏度和选择性。本文列举了基于电化学传感器开发的测定生物样本中神经递质的方法及相应的检出限,详见表2。

在电化学传感器检测方法中,除了碳基电极应用较为广泛以外,近些年来,一些新兴的纳米材料用作电极材料应用于体内神经递质的含量测定。例如,基于离子在两种不混溶电解质溶液之间的界面上转移的纳米移液管电极可以用来检测多种神经递质,包括具有电化学氧化还原活性的5-HT和非氧化还原活性的ACh等神经递质[58]。用碳量子点修饰的NiAl层状双氢氧化物(NiAl-LDH/CD)复合材料是电化学生物传感器发展中出现的新兴材料,该复合材料是采用水热法合成具有交联纳米片结构和高比表面积的花状纳米材料,可修饰GCE电极应用于神经递质的检测[59,60]。

表 2 基于电化学传感器方法测定神经递质Table 2 Determination of NTs based on an electrochemical sensor method

DA: dopamine; EP: epinephrine; GCE: glassy carbon electrode; CPE: carbon paste electrode; SPE: screen-printed electrode PGE: pencil graphite electrode; ITO: indium tin oxide; CNT: carbon nanotube; PPy: polypyrrole; MWCNT: multiwalled carbon nanotubes. EDAS:N-[3(trimethoxysilyl)propyl]ethylenediamine; AuNPs: Au nanoparticles: AzrS: Alizarin red S; 2-CBF/AZ: 2-chlorobenzoyl ferrocene/Ag-ZnO; IL: ionic liquid; Gr: graphene; Fe3O4NPs-MWCNT-poly: Fe3O4nanoparticles-multiwalled carbon nanotubes-poly; ILC/RGO: ionic liquid crystal/reduced grapheneoxide; OFMs: olive-like Fe2O3microspheres; 3D HGBs: three-dimensional hollow graphene balls; rGO: re-dispersed graphene oxide; MIP: molecularly imprinted polymer.

2.6 其他检测方法

2.6.1光学传感器

2.6.2生物传感器

G蛋白偶联受体(GPCR)具有拓扑结构,对内源性神经递质具有高度特异性,构成大多数神经递质和神经调节剂的受体。Jing等[65]最近通过使用GPCR支架,开发了一种具有高信噪比的ACh传感器,可检测体内/体外环境中ACh的信号,在从几种动物物种制备的十几种类型的神经元和非神经元细胞中通过转染病毒和转基因表达得到验证。结果显示,该传感器选择性地响应外源和内源ACh信号。最近,Moreira等[66]提出了基于混合酶燃料电池的第一传感器用于ACh的实时原位检测,该方法不需要样品处理,响应时间在3 min内。这种方法说明ACh的实时监测朝着自动供电的廉价设备迈出了重要一步。

3 应用

一些神经系统疾病与神经递质浓度的微小变化密切相关,因此,神经递质的测定成为疾病诊断和监测以及治疗干预的重要手段。多种分析方法已被用于研究神经系统疾病中神经递质水平的变化,如AD、抑郁症、唐氏综合征、亨廷顿病、帕金森病和精神分裂症等。探讨各种疾病模型中特定神经递质的动态变化可为研究人员提供有关潜在致病机制的重要信息,有效的神经递质体内监测可以反映治疗效果,从而为临床合理用药乃至新的药物设计和新治疗方法提供科学依据。

3.1 AD

AD是一种神经退行性疾病,其特征是记忆和其他认知功能逐渐丧失。已有研究[67]表明,胆碱能神经元的退化在与AD相关的认知衰退中起主要作用。如前所述,神经递质是通过在突触前神经元发送信号来维持突触和认知功能的必需的神经化学物质,通过研究神经递质的变化以确定它们在AD中的作用,并有助于诊断AD。Zhao等[30]采用原位超声辅助衍生DLLME前处理技术结合LC-MS联用技术检测AD模型大鼠尿液中氨基酸类和单胺类神经递质的含量。该方法可在16 min内同时检测22种分析物,检出限达1×10-4～1×10-2nmol/L。应用该方法对正常组和AD模型组大鼠尿液中的神经递质含量进行检测,结果(见图2)表明,AD模型组大鼠尿液中DL-3,4-二羟基苯基乙二醇(DHPG)以及3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇(MHPG)含量显著高于正常对照组(p<0.01)。GABA和Gly也明显高于对照组,而AD大鼠尿中L-3,4-二羟基苯基丙氨酸(L-DOPA)、DA、NE、去甲变肾上腺素(NME)、3-甲氧基酪胺盐酸盐(3-MT)、3,4-二羟基苯乙酸(DOPAC)、高香草酸(HVA)、DL-3,4-二羟基扁桃酸(DOMA)、香草扁桃酸(VMA)、5-HT和Asp水平显著低于正常对照组(p<0.01)。Hsieh等[68]建立了一种简单的环糊精毛细管区带电泳方法,并配有激光诱导荧光检测器,用于分析兴奋性氨基酸Asp和Glu。血浆和脑脊液(CSF)样品经离心过滤装置预处理后,去除高分子量蛋白质,然后用106-羧基荧光素N-羟基琥珀酰亚胺酯在二甲基亚砜(DMSO)中衍生化。应用该方法测定了26例AD患者血浆和脑脊液中Asp和Glu的浓度,并研究了这些递质浓度与疾病严重程度的关系(见图3)。统计学结果显示,血浆和脑脊髓液中Asp及Glu浓度与AD严重程度呈负相关。以上分析方法在AD疾病的临床诊断,监测治疗效果和药物评价方面具有潜在价值。

图 2 正常和AD组(a)DA及其代谢产物和(b)5-HT及其代谢产物的浓度(n=8)[30]Fig. 2 Concentrations of (a) DA and its metabolites and (b) 5-HT and its metabolites in normal and Alzheimer disease (AD) groups (n=8)[30] L-DOPA: L-3,4-dihydroxyphenylalanine; E: epinephrine; 3-MT: 3-methoxytyramine hydrochloride; NME: normetanephrine; ME: metanephrine; DOPAC: 3,4-dihydroxyphenylacetic acid; HVA: homovanillic acid; DOMA: DL-3,4-dihydroxymandelicacid; DHPG: DL-3,4-dihydroxyphenyl glycol; VMA: vanillylmandelic acid; MHPG: 4-hydroxy-3-methoxyphenylglycol; 5-HIAA: 5-hydroxyindole-3-acetic acid.

图 3 血浆和脑脊液(CSF)中D-Asp/L-Asp和Glu的电泳图谱[68]Fig. 3 Electropherograms of D-Asp/L-Asp and Glu in plasma and cerebrospinal fluid (CSF)[68] a. plasma sample from an AD patient; b. plasma sample from a non-AD patient; c. CSF sample from an AD patient; d. CSF sample from a non-AD patient. Peak Nos.: 1. D-Glu; 2. L-Glu; 4. L-Asp.

3.2 抑郁症

抑郁症是一种以情绪低落、自我价值感降低、快感缺失为主要症状的精神类疾病。重度抑郁症(MDD)涉及多种神经递质的紊乱,包括GABA、DA、5-HT等[69]。Wojnicz等[25]建立了一种快速的LC-MS方法测定大鼠脑组织中的神经递质:EP、NE、Glu、GABA、DA、5-HT、5-羟基吲哚乙酸(5-HIAA)及MHPG。定量限为0.25～250 μg/L。此方法成功应用于检测Nrf2基因剔除的小鼠抑郁症模型内源性神经递质及其代谢产物,结果发现,小鼠海马样本中NE、5-HT、DA、5-HIIA、Glu 5种化合物在基因剔除小鼠与正常小鼠之间无明显差别,但基因剔除小鼠海马样本中GABA的含量明显减少。该研究首次报道Nrf2基因剔除的小鼠海马组织中GABA水平,也支持了抑郁症Glu缺陷假说。该实验有助于寻找抑郁症和其他相关疾病的生物标志物,提高神经递质水平变化相关疾病的诊治水平和效率。

3.3 缺血性中风

缺血性中风是指脑血栓形成或在脑血栓的基础上导致脑梗死、脑动脉堵塞而引起的偏瘫和意识障碍,不仅发病率高,也具有较高的病亡率以及致残率。神经元中兴奋性神经递质Glu和Asp过度释放产生的神经毒性与脑缺血性损伤有关,目前这些神经递质已成为科学家们研究中风治疗方法的目标[70]。王展等[71]采用LC-MS/MS法测量比较卒中组以及正常对照组血浆内的5-HT、NE、Glu和GABA 4种神经递质的浓度。同时比较不同卒中严重程度患者的4种神经递质浓度。结果表明,血浆神经递质与正常对照组相比,血浆5-HT、NE和Glu有上升趋势,GABA有下降趋势;缺血性卒中急性期血浆神经递质水平与正常对照组相比有差异,中重度卒中患者的血浆5-HT水平升高较轻度卒中患者显著。

3.4 精神分裂症

精神分裂症是一种相对常见、慢性且常常具有毁灭性的神经精神疾病。严重症状通常出现在青春期晚期或成年早期,涉及认知、情绪和行为异常。到目前为止,还没有生物学验证或实验室试验可以诊断该疾病,也没有生物标志物可以评价治疗效率。血浆中神经递质水平含量的变化可能会影响神经分裂症患者的情绪敏感程度和治疗效果。Diego等[72]采用LC-MS/MS法同时检测人血浆中多种神经递质和氨基酸的含量,血浆样本来自35例精神分裂症患者(其中27例患者接受氯氮平药物治疗,8例患者接受奥氮平治疗)和38名健康志愿者。该测定方法可实时监测治疗效果。结果显示,与对照组(健康志愿者)比较,奥氮平治疗精神分裂症患者血浆中蛋氨酸水平显著较高,氯氮平治疗精神分裂症患者血浆中Glu水平明显升高。该方法可成功应用于监测临床治疗效果。

4 结论与展望

神经递质在诊断和治疗精神障碍疾病中起着至关重要的作用,因此在各种环境中实时、准确地检测其浓度尤为必要。生物介质中神经递质的定量测定可采用仪器检测方法,电化学检测方法及一些基于光学传感器和生物传感器的检测方法。仪器分析方法具有良好的选择性和较低的检出限。电化学传感器法具有较好的重复性、较高的准确性以及较宽的线性范围,并且具有低检出限和实时测量的优势,可用于神经递质的快速检测,但暂时无法实现多种神经递质的同时测定。基于光谱分析法开发的新型生物传感器应用于神经递质的检测,可达较低的检出限并具有良好的选择性,但目前还处于理论研究阶段。未来关于神经递质检测的研究方向还是聚焦于开发出同时检测多种神经递质且无相互干扰的分析方法。应用于体内检测时,需要考虑生物兼容性、稳定性、灵敏度、重复性等。碳基材料用于神经递质检测具有良好的生物兼容性,但目前研究还处于初级阶段;仪器分析方法则致力于开发操作简便、省时省力、对环境友好的前处理方式,且可同时检测多种神经递质。随着各类分析技术的发展,越来越多新技术和新方法有望实现快速、准确、实时检测生物基质中的神经递质,为神经系统疾病诊断和治疗提供科学依据和技术支撑。