基于叠氮基-氰基点击化学的苯硼酸亲和硅胶的制备及其在糖蛋白/糖肽选择性富集中的应用

2019-03-08张丽媛王立恒王丽莉董佩佩刘和真赵艳艳

色谱 2019年3期

张丽媛, 王立恒, 王丽莉, 董佩佩, 刘和真, 赵艳艳*

(1. 大连医科大学, 辽宁大连 116044; 2. 大连市第二人民医院骨科康复中心, 辽宁大连 116001)

蛋白质的糖基化是最重要的翻译后修饰之一,其在细胞表面识别、免疫应答、蛋白质折叠、转运、神经传导等生物转化过程中都起着重要的作用[1]。因此,糖蛋白质组学研究在生物学和临床应用中都扮演重要角色[2,3]。然而,糖蛋白在生物样品中丰度较低,在质谱检测时容易被其他非糖蛋白抑制,因此需发展高效的糖肽/糖蛋白的分离富集方法以提高糖肽/糖蛋白的鉴定效率。

目前糖肽/糖蛋白的分离富集方法主要有凝集素亲和法[4]、肼化学法[5]、亲水相互作用法[6]、硼亲和色谱法[7,8]、体积排阻法[9]等,这些方法各有优缺点。其中硼亲和色谱法富集糖肽/糖蛋白的原理是通过调节溶液的pH值使硼亲和材料上的硼酸基团与糖的1,2-顺式二羟基产生可逆结合,碱性条件下结合,酸性条件下解离,上样富集条件的pH值对糖肽/糖蛋白的保留起到重要的作用[10,11]。硼亲和色谱法具有显著的优势,如操作简单、富集无偏向性、重现性好。新型硼酸亲和材料的开发作为硼亲和色谱法的核心领域,引起研究者极大的重视。现有的方法[7,8]大多在追求高糖蛋白/糖肽富集选择性的同时,兼顾生物相容性,合成操作简便。

“点击化学”在诸多领域得到了广泛的发展与应用,特点是选择性高、转化率高、条件温和[12,13]。目前应用最多的“点击化学”反应是叠氮-炔基加成反应(CuAAC)[14]。然而,CuAAC反应使用Cu(I)作为催化剂,残留的重金属Cu会带来生物毒性,从而限制了这种反应的应用。无铜催化的“点击化学”叠氮基-氰基加成反应[15,16]不仅操作简单、反应高效,而且避免了CuAAC反应由重金属Cu带来生物毒性的问题,生物相容性好,适用于硼酸亲和材料的制备。相比较另一种比较热门的无铜催化“点击化学”方法(巯基-炔基点击化学法)[17],叠氮基-氰基点击化学法具有一个显著的优势,即四唑基团反应产物的形成。四唑基团能够提供亲水作用力,因此,采用叠氮基-氰基点击化学法合成的硼亲和材料不仅能够提供硼酸亲和作用力,而且能够提供亲水作用力。糖蛋白和糖肽在硼酸亲和作用力和亲水作用力下的保留均强于它们的对应物,因此,采用叠氮基-氰基点击化学法合成的硼亲和材料有望具备较强的糖蛋白和糖肽的富集选择性。然而目前没有采用基于叠氮基-氰基点击化学法合成硼亲和材料的报道,有必要将此合成方法应用到硼亲和材料的制备合成中去。就硼亲和材料的基质而言,常用的基质有磁珠[17,18]、聚合物整体柱[19-21]、分子印迹聚合物[22]、纳米颗粒[23-25]、金属氧化物[26]等。相比较其他类型基质,硅胶是高效液相色谱载体最常用的基质类型,具有更为实用的应用价值,在大规模糖蛋白质组学中的应用研究前景较好。因此,开发生物相容性好、键合量高、制备方法简便的硅胶基质硼酸亲和材料十分有必要。

本研究基于叠氮基-氰基无铜催化的“点击”化学反应,制备了一种以硅胶为基质的新型苯硼酸亲和硅胶(TCNBA)材料,将4-氰基苯硼酸键合到叠氮基修饰的硅胶表面。利用红外光谱和X射线光电子能谱对材料进行表征以确定键合反应成功。在优化条件的基础上,以辣根过氧化物酶(HRP)、免疫球蛋白G(IgG)、核糖核酸酶B(RNaseB)、牛血清白蛋白(BSA)为对象,分别考察材料对糖肽和糖蛋白的富集选择性。并将TCNBA应用于实际样品人血清中糖蛋白的选择性富集。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Ultraflex III MALDI-TOF/TOF MS(德国Bruker Daltonics公司); SDS(十二烷基磺酸钠)凝胶电泳槽(北京市六一仪器厂);红外光谱采用Nicolet 20 DXB FT-IR仪器(美国Nicolet公司)进行测试、X射线光电子能谱图采用ESCALAB 250Xi(美国Thermo Fisher公司)进行测试。

叠氮基硅胶(实验室自制,制备方法参照文献[27]); 4-氰基苯硼酸(纯度99%)、碳酸氢铵(化学纯)、醋酸亚铁(纯度99%)、三氟乙酸(质谱纯)、甲酸(质谱纯)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF,化学纯)、乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na2,化学纯)均购买自百灵威科技有限公司(北京);冰醋酸(化学纯)、甲醇(化学纯)、乙醇(化学纯)均购自天津市科密欧化学试剂有限公司;乙腈(ACN,质谱纯)购自德国Darmstadt公司; HRP、IgG、RNaseB、BSA、二硫苏糖醇(DTT,质谱纯)、尿素(质谱纯)、碘乙酰胺(IAA,质谱纯)、2,5-二羟基苯甲酸(2,5-DHB,质谱纯)均购自美国Sigma公司;胰蛋白酶购自美国Promega公司;正常人血清、考马斯亮蓝(R-250)均购自北京索莱宝科技有限公司。文中溶液配制比例,除特别说明外,均为体积比。

1.2 TCNBA的制备

TCNBA合成反应如图1所示,操作过程如下:称取0.5 g叠氮基硅胶,与10 mL含0.25 g 4-氰基苯硼酸的DMF/甲醇(9∶1, v/v)溶液混合,混悬均匀后,加入30 mg醋酸亚铁,在氮气保护的条件下,于80 ℃持续搅拌反应24 h。将反应体系冷却至室温后,依次用EDTA-Na2/H2O(1∶9,质量比)、水、甲醇各洗涤3次,于50 ℃干燥过夜,即得TCNBA。

图 1 TCNBA材料的合成方法Fig. 1 Triazo-cyanide boronic acid functionalized material (TCNBA) synthesis methodDMF: N,N-dimethylformamide; MeOH: methanol.

1.3 糖肽富集

1.3.1蛋白质酶解

称取0.5 mg HRP溶于100 μL含有8 mol/L尿素的50 mmol/L碳酸氢铵缓冲溶液中,于56 ℃反应10 min。加入20 μL 100 mmol/L DTT溶液,于56 ℃反应1 h。冷却至室温后,将5 μL 50 mmol/L IAA溶液加入到混合物中,常温避光孵育30 min。将5 mmol/L碳酸氢铵溶液与胰蛋白酶以40∶1(m∶m)的比例混合,于37 ℃中孵育16 h。所得的溶液冷却到室温后置于-80 ℃保存备用。糖肽富集所用的IgG、RNaseB、BSA的酶解物均用此种方法酶解。

1.3.2标准糖蛋白酶解物的富集

称取2 mg TCNBA,加入200 μL 80%(体积分数,下同)ACN溶液,使其成为均匀的混悬液(10 g/L)。取50 μL的混悬液与酶解物混合,加入200 μL 80% ACN/NH3H2O溶液(pH 11),室温下涡旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度离心5 min后,弃除上清液;重复加液洗涤一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脱,以10 000 r/min的速度离心5 min后,取上清液冷冻干燥。干燥后,加入2 μL基质溶液(含25 g/L 2,5-DHB的70%ACN/1%FA溶液)溶解后点样,进行MALDI-TOF MS分析(设置线性正离子模式及延迟离子提取方法,延迟时间为90 ns,提取电压为20 kV,每个质谱图由30个激光点的结果加和得到)。HRP、RNaseB、IgG的酶解物均用此种方法富集。

1.3.3糖蛋白与非糖蛋白酶解液混合物的富集

取50 μL的TCNBA混悬液与5 μL HRP∶BSA=1∶10(物质的量比)蛋白质酶解液混合,加入200 μL80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室温下涡旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度离心5 min后,去除上清液;重复加液洗涤一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脱,以10 000 r/min的速度离心5 min后,取上清液冷冻干燥。干燥后,加2 μL的基质溶液溶解,进行MALDI-TOF MS分析。

1.4 糖蛋白富集

1.4.1糖蛋白与非糖蛋白混合物富集

取3个分别装有50 μL TCNBA混悬液的Eppendorf离心管,依次加入物质的量比为HRP∶BSA=1∶1、HRP∶BSA=1∶10、HRP∶BSA=1∶20的蛋白质混合溶液进行上样。然后分别加入200 μL 80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室温下涡旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度离心5 min后,弃去上清液。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脱,以10 000 r/min的速度离心5 min,将所得的洗脱液冷冻干燥,然后进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)试验。IgG、RNaseB与BSA混合物中的糖蛋白均用此方法富集。

1.4.2多种糖蛋白与非糖蛋白混合物富集

取50 μL TCNBA混悬液,等摩尔依次加入HRP、IgG、RNaseB、BSA的蛋白质溶液混合,再加入200 μL 80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室温下涡旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度离心5 min后,弃去上清液,重复加液洗涤一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脱,以10 000 r/min的速度离心5 min,将所得的洗脱液冷冻干燥,然后进行SDS-PAGE试验。

1.4.3实际样品中糖蛋白富集

取50 μL TCNBA混悬液与5 μL正常人血清混合,加入200 μL 80%ACN/NH3H2O溶液(pH=11),室温下涡旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度离心5 min,去除上清液,重复加液洗涤一次。再加入200 μL 50%ACN/1%FA溶液洗脱,室温下涡旋孵育1 h,以10 000 r/min的速度离心5 min,将所得的洗脱液冷冻干燥,然后进行SDS-PAGE试验。

2 结果与讨论

2.1 TCNBA的表征

基于叠氮基-氰基的“点击”化学法反应过程如图1所示,4-氰基苯硼酸在氮气保护条件下,以醋酸亚铁作为催化剂,键合到叠氮基硅胶表面。

图 2 叠氮基硅胶和TCNBA的红外图谱Fig. 2 IR spectra of azide modified silica gel and TCNBA

将所制备得到的TCNBA进行红外光谱法表征,通过材料合成前后红外光谱吸收峰信息的变化来判断材料是否成功合成。结果如图2所示,在叠氮基硅胶和TCNBA中,3 380 cm-1附近的吸收峰增强,为4-氰基苯硼酸表面-OH的振动;在1 638 cm-1处的吸收峰为苯环双键区的振动,苯环的吸收峰增强,表明4-氰基苯硼酸已经键合到叠氮基硅胶上。同时在TCNBA中的1 335 cm-1处为B-O吸收峰,进一步的表明了材料表面成功的键合上硼酸基团。结果表明TCNBA制备成功。

为了更好地验证硼酸已经被成功地键合到材料表面,进行了X射线光电子能谱表征试验,对材料表面硼元素进行能级谱扫描。如图3所示,191 eV处出现了硼元素的能谱峰(能谱峰定性数据来自于NIST X-ray Photoelectron Spectroscopy Database)。结果表明,材料合成成功,4-氰基苯硼酸已成功键合到叠氮基硅胶表面。

图 3 TCNBA的X射线光电子能谱图Fig. 3 X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) spectrum of TCNBA

2.2 TCNBA用于糖肽富集

2.2.1标准糖蛋白酶解物的富集

为了考察TCNBA的糖肽富集选择性,本研究选取了两种标准糖蛋白,HRP和IgG的胰蛋白酶酶解物作为研究对象。首先对TCNBA的糖肽富集条件进行了优化,硼酸基团能够在碱性条件下和糖肽上的糖基结合,在酸性条件下解离。此外,硼酸上的羟基能够提供氢键作用力,因此条件优化过程中同时考虑硼酸亲和作用力和氢键作用力的特点。优化后的上样和孵育条件为高有机相碱性条件,洗脱条件为低有机相酸性条件。

图 4 HRP和IgG酶解液用TCNBA富集前后的MALDI-TOF MS图谱Fig. 4 MALDI-TOF MS spectra of the tryptic digestion of horse radish peroxidase and immunoglobulin G (IgG)The glycopeptide signals were all marked with m/z, and the non-glycopeptide signals were not marked with m/z.

m/zGlycan structureAmino acid sequenceBefore enrichmentAfter enrichment1021GlcNAc1Fuc1NVGLNR√1843Man3GlcNAc2Fuc1Xyl1NVGLNR√2218Man3GlcNAc2Fuc1LHFHDCFVNGCDASILLDNTTSFR√2508GlcNAcFucGlcNAcMan3XylASILLDN#TTSFR√2612Man3GlcNAc2Fuc1Xyl1MGNITPLTGTQGQIR√3146[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1GLCPLNGN#LSALVDFDLR. Oxide√√3322[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1QLTPTFYDNSCPN#VSNIVR√3354[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1SFAN#STQTFFNAFVEAMDR√√3607[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1NQCRGLCPLNGN#LSALVDFDLR√3672[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1GLIQSDQELFSSPN#ATDTIPLVR√√3896[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1LHFHDCFVNGCIASILLDN#TTSFR√√4057[Hex]3[HexNAc]2[Xyl]1QLTPTFYDNSC(AAVESACPR)PN#VSNIVR-H2O√4222[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1QLTPTFYDNSC(AAVESACPR)PN#VSNIVR√4986[Hex]3[HexNAc]2[Fuc]1[Xyl]1LYN#FSNTGLPDPTLN#TTYLQTLR√√

The structure information is taken from the literature[29]. GlcNAc:N-acetylglucosamine; Fuc: fucose; Man: mannose; Xyl: xylose; Hex: hexose; HexNAc:N-acetylhexosamine. #: glycosylation sites; √: observed signals.

采用MALDI-TOF MS对糖肽进行检测。以标准糖蛋白HRP和IgG的酶解液为分析对象来考察TCNBA对糖肽的选择性与富集效果。富集方法见1.3.2节。HRP糖肽为复合型糖链,主要包含9个潜在的糖基化位点,HRP酶解物在富集前只检测到了5个糖肽(m/z3 146、3 354、3 672、3 896、4 986,见图4a和表1),而经材料富集后不仅检测到了13个糖肽(m/z1 021、1 843、2 218、2 508、2 612、3 322、3 354、3 607、3 672、3 896、4 057、4 222、4 986,见图4b),而且去除了大部分非糖肽杂质的干扰。IgG糖肽主要含有中性糖的复合型糖链,在富集前质谱分析只检测出了3个微弱的糖肽信号(m/z2 286、2 602、2 763,见图4c和表2),而经材料富集后检测到了11个糖肽(m/z2 286、2 456、2 602、2 635、2 763、2 797、2 838、2 927、2 958、3 000、3 250,见图4d),并且去除了大部分非糖肽杂质的干扰。结果表明,TCNBA对糖肽具有较好的选择性和富集效果,糖肽信号强度得到较大程度增强,并且去除了大部分非糖肽杂质的干扰。TCNBA从HRP酶解液中富集的糖肽数量相比文献[27]报道的其他材料富集结果有一定差距,这是因为TCNBA所采用的是苯硼酸功能基团,其对于糖肽富集选择性要弱于文献中所采用的苯并硼氧醇功能基团[28]。尽管如此,所制备的TCNBA具有较好的糖肽富集选择性,对于HRP和IgG的蛋白酶解液的富集效果是显而易见的,这是由于材料不仅能够提供硼酸亲和作用力,而且能够提供氢键作用力和静电作用力。叠氮硅胶和氰基苯硼酸反应后生成的四唑基团是亲水作用力增强的原因。整个制备中没有采用重金属,生物相容性好,操作简便,这些也成为TCNBA作为糖肽选择性富集材料的优势。

表 2 经TCNBA富集后免疫球蛋白G(IgG)酶解物中糖肽的信息Table 2 Information of glycosylated peptides in IgG digestion after TCNBA enrichment

The structure information is from the literature[29]. #: glycosylation sites; √: observed signals. NeuAc:N-acetylneuraminic acid.

图 5 HRP∶BSA=1∶10(物质的量比)酶解液富集(a)前、(b)后MALDI-TOF MS图谱Fig. 5 MALDI-TOF MS spectra of tryptic digestion of HRP∶BSA=1∶10 (amount of substance ratio) (a) before and(b) after the enrichment The glycopeptide signals were all marked with m/z, and the non-glycopeptide signals were not marked with m/z.

2.2.2糖蛋白与非糖蛋白酶解物混合物的富集

为进一步验证本材料选择性富集糖肽的效果,对HRP∶BSA=1∶10(物质的量比)的酶解物混合物进行富集,富集方法见1.3.3节。结果如图5所示,HRP∶BSA=1∶10(物质的量比)的酶解物混合物在富集前只检测到3个糖肽(m/z1 021、3 354、3 672,见图5a),并且含有大量高信号强度的非糖肽杂质峰;而经材料富集后,不仅去除了大部分非糖肽杂质的干扰,还检测到了5个高信号强度的糖肽(m/z2 612、3 146、3 354、3 672、4 986,见图5b),表明本材料对糖肽具有较强的选择性和富集效果。

2.3 TCNBA用于糖蛋白的富集

2.3.1糖蛋白富集选择性考察

为了考察TCNBA的糖蛋白富集选择性,选用了HRP、IgG、RNaseB作为标准糖蛋白的研究对象。3种标准糖蛋白结构各有特点,糖型、糖链长度、亲水性大小均有差异。其中HRP中性糖和氨基糖约占18%,主要有甘露糖、木糖和阿拉伯糖等。IgG是血清中免疫球蛋白的主要成分,主要含有中性糖。RNaseB是一种带有甘露糖糖链的糖蛋白。

图 6 采用TCNBA材料进行蛋白混合物分离富集的SDS-PAGE凝胶电泳图Fig. 6 Sodium salt-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of the protein mixtures using the SDS-PAGE Lane 1: marker. Lanes 2 and 3: protein∶BSA with the amount of substance ratio of 1∶1 before and after the enrichment, respectively. Lanes 4 and 5: protein∶BSA with the amount of substance ratio of 1∶10 before and after the enrichment, respectively. Lanes 6 and 7: protein∶BSA with the amount of substance ratio of 1∶20 before and after the enrichment, respectively.

将HRP、IgG、RNaseB 3种糖蛋白均与BSA分别按照1∶1、1∶10、1∶20的物质的量比混合上样,洗脱后将洗脱液冷冻干燥进行12%SDS-PAGE凝胶电泳分离,考马斯亮蓝染色后所得结果如图6所示。其中2、4、6泳道分别为HRP(图6a)、IgG(图6b)、RNaseB(图6c)与BSA的1∶1、1∶10、1∶20物质的量比混合物富集前的条带,3、5、7泳道分别为富集后对应的条带,富集后与富集前相比,不仅去除了非糖蛋白BSA,而且基本完全保留了糖蛋白HRP(图6a)、IgG(图6b)、RNaseB(图6c)。结果表明,TCNBA用于富集糖蛋白具有较高的选择性。

2.3.2多种糖蛋白与非糖蛋白混合物的富集

为了进一步验证TCNBA同时富集多种糖蛋白的选择性,将该材料应用于多种糖蛋白与非糖蛋白混合物的富集。即将HRP、IgG、RNaseB和BSA4种蛋白按照等物质的量比混合上样,将洗脱液冷冻干燥后进行SDS-PAGE凝胶电泳分离,考马斯亮蓝染色处理。结果如图7所示,富集后与富集前相比较,去除了非糖蛋白BSA的干扰,并且3种糖蛋白均得到保留,进一步表明了本材料用于富集糖蛋白具有较好的选择性和富集效果。

图 7 采用TCNBA材料对蛋白质混合物分离富集前后的SDS-PAGE图Fig. 7 SDS-PAGE analysis of the protein mixture before and after the enrichment using the TCNBA material Lane 1: marker; lane 2: HRP∶IgG∶RNaseB∶BSA=1∶1∶1∶1 (amount ratio of substance); lane 3: HRP∶IgG∶RNaseB∶BSA=1∶1∶1∶1 (amount ratio of substance) after the enrichment.

图 8 采用TCNBA材料富集人血清的SDS-PAGE凝胶电泳图Fig. 8 SDS-PAGE analysis of human serum before and after enrichment using the TCNBA material Lane 1: marker; lane 2: before the enrichment; lane 3: after the enrichment. Trf: transferrin; HSA: human serum albumin.

2.3.3实际样品中糖蛋白的富集

在人血清的实际样品中,主要含有转铁蛋白(Trf)、血清白蛋白(HSA)、IgG等,其中Trf和IgG为糖蛋白,HSA为非糖蛋白。将TCNBA用于对正常人血清中糖蛋白的富集将有助于理解方法的实际应用价值。富集前后的SDS-PAGE凝胶电泳结果见图8。血清样品在富集前所含蛋白质大部分为HSA,含量明显高于Trf和IgG;经富集后的血清,不仅去除了一些杂质蛋白质的条带,非糖蛋白HSA得到较明显的去除,糖蛋白Trf和IgG得到了很大程度的保留。与已报道的文献[28]相比,显著提高了非糖蛋白HSA的去除效果,表明本材料用于人血清中糖蛋白富集具有高效性和选择性。