自发性糖尿病大鼠的抑郁症行为与钙网织蛋白前体、原肌球蛋白1、细胞分裂素活化蛋白激酶1和活化分裂素蛋白激酶1 表达的关联

丁迎 马计 方丽洁 肖娟 张竞文 邓玉洁

1武汉市武东医院（武汉市第二精神病医院）康复科（武汉430084）；2湖北文理学院附属襄阳市中心医院内分泌科（湖北襄阳441021）；3澳门城市大学心理分析研究院（澳门999078）

抑郁症是一种情感性精神障碍疾病，患者的主要临床表现包括持久的心境低落且思维与行为异常，患者往往出现抑郁、自卑、情绪低落等悲观心境状态，部分患者存在自杀倾向及行为，近年来，抑郁症的发病率呈逐年攀升的趋势。抑郁症的发病机制较为复杂，由于神经退行性病变的重要病理基础之一即为海马神经元凋亡，为此研究人员推断海马神经细胞的凋亡可能与抑郁症的发病相关［1-3］。流行病学数据表明，至少有三分之一的糖尿病患者会出现相关抑郁障碍，而抑郁症患者发生糖尿病的风险会增加37%。近日，第52 届欧洲糖尿病研究协会（EASD）年会上公布的一项全球研究数据显示，中国2 型糖尿病患者抑郁症发生率为10.8%。CUMS 是一种经典的抑郁症模型制作方案，该方案已经得到了国内外的高度认可，此模型能够通过对抑郁症的环境诱因进行模拟，从而产生抑郁症的主要临床表现及其引发的脑代谢变化。钙网织蛋白前体（calreticulin precursor）、原肌球蛋白1（tropomyosin l）、细胞分裂素活化蛋白激酶1（milogen activated prolein kinase l）以及双重特异性的活化分裂素蛋白激酶1（dual specificity mitogen-activated protein kinase l）是4 种与神经发生相关的蛋白，已有研究指出上述4 种蛋白在抑郁症大鼠海马组织中含量显著下调。本研究的创新点是探讨抑郁症大鼠的抑郁行为与神经发生相关蛋白之间的相关性，以为临床诊治提供理论研究和治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 本研究以20 只成年雄性健康大鼠（对照组）、40 只自发性糖尿病大鼠为研究对象，采用随机数字法将40 例自发性糖尿病大鼠分为糖尿病组与糖尿病抑郁组，糖尿病抑郁组受试大鼠构建抑郁模型，每只大鼠单笼喂养，温度22～24℃，相对湿度60%，自然光照，保持良好通风通风。

1.2 研究方法

1.2.1 CUMS 法构建抑郁大鼠模型［4］糖尿病抑郁组受试大鼠进行下列7 种刺激：夹尾1 min、热烘5 min、4 ℃冰水游泳5 min、水平振荡30 min、禁水24 h、禁食24 h、昼夜颠倒。夹尾指将大鼠置于固定笼内，将尾部露出，采用止血钳在距尾根1 cm 处夹住并持续1 min；热烘指将大鼠置于45 ℃恒温水浴箱内5 min；冰水游泳指将大鼠置于装有约15 cm 高的4 ℃冰水桶内5 min；振荡指将大鼠置于160 次∕min 的告诉振荡器内30 min；禁水指大鼠7：00am 次日7：00am 的24 h 期间不喂水；禁食指大鼠7：00am 次日7：00am 的24 h 期间不喂食；昼夜颠倒指将大鼠于7：00a.m。置于内面漆黑且不透光的黑暗状态，至7：00p.m 时日光灯使其处于光照条件下直到次日7：00a.m。上述刺激每日进行1种，且每2 种刺激不可连续出现，共计3 周，具体安排如下：禁水，第1、8、15、22日；热烘，第2、9、16日；禁食，第3、10、17日；昼夜颠倒，第4、11、18日；冰水游泳，第5、12、19日；振荡，第6、13、20日；夹尾，第7、14、21日。

1.2.2 蔗糖水消耗试验、旷野试验测定大鼠抑郁行为 （1）蔗糖水消耗试验：两组受试大鼠于禁水次日，测定其1%蔗糖溶液的饮用量。（2）旷野试验：造模结束后对受试大鼠进行旷野试验，记录其运动情况。实验敞箱为长、宽、高分别为80 cm、80 cm、40 cm 的立柱体，内空、周壁为黑色，用黑线将地面划分成等面积（16 cm×16 cm）的25 块。将大鼠置于中心方格内，水平活动得分指大鼠穿越地面方块的数量，垂直活动指大鼠的直立次数，每只受试大鼠仅测定1 次，每次3 min，在安静的条件下于早7：30 至中午12：00 时间段内进行测定。

1.2.3 受试大鼠海马组织中蛋白表达水平测定 海马组织的制备，采用锐利的剪刀对大鼠进行快速断头，采用提前预冷（4 ℃）生理盐水对脑组织血液进行冲洗，将多余肌肉减掉，以十字形剪开颅底，采用血管钳将颅骨分离后在保证脑组织完整的前提下将其取下；采用眼科镊对海马表面的脑组织与筋膜进行彻底剥离；将眼科镊凹面向上，向两侧轻轻完撑开，将海马取下，称重并记录，置于冻存管中密封后保存在液氮中。采用Western法测定海马组织中钙网织蛋白前体、原肌球蛋白1、细胞分裂素活化蛋白激酶1 以及双重特异性的活化分裂素蛋白激酶1 4 种蛋白表达水平，兔抗大鼠钙网织蛋白前体多克隆抗体、兔抗大鼠原肌球蛋白1 多克隆抗体、兔抗大鼠细胞分裂素活化蛋白激酶1 多克隆抗体、兔抗人活化分裂素蛋白激酶1 多克隆抗体购自上海抚生实业有限公司，操作步骤严格按照说明书进行。

1.3 统计学方法 本研究采用SPSS 20.0统计分析软件（美国IBM 公司）进行处理；计量资料采用“均数±标准差”表示，组间比较采用单因素方差分析或者重复测量的方差分析，两两比较采用LSD-t检验；计数资料采用百分率（%）表示，组间比较采用χ2分析；P＜0.05代表差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 3组受试大鼠应激第1、8、15日饮用蔗糖水量比较 应激第1、8日，3 组受试大鼠饮用蔗糖水量不存在显著差异（P＞0.05）；应激第15、22日，糖尿病抑郁组受试大鼠饮用蔗糖水量明显低于对照组及糖尿病组，差异具有统计学意义（P＜0.05），对照组与糖尿病组受试大鼠饮用蔗糖水量不存在显著差异（P＞0.05）。见图1。

图1 3 组受试大鼠应激第1、8、15日饮用蔗糖水量比较Fig.1 Comparison of the rats in drinking water for first，eighth，fifteenth days under stress

2.2 3组受试大鼠旷野试验水平、垂直得分比较 糖尿病抑郁组受试大鼠旷野试验水平得分、垂直得分均明显低于对照组及糖尿病组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组与糖尿病组受试大鼠大旷野试验水平得分、垂直得分不存在显著差异（P＞0.05）。见图2。

2.3 3组受试大鼠钙网织蛋白前体表达水平比较 糖尿病抑郁组受试大鼠钙网织蛋白前体表达量明显低于对照组及糖尿病组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组与糖尿病组受试大鼠钙网织蛋白前体表达水平不存在显著差异（P＞0.05）。见图3。

2.4 3组受试大鼠原肌球蛋白1表达水平比较 糖尿病抑郁组受试大鼠原肌球蛋白1 表达量明显低于对照组及糖尿病组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组与糖尿病组受试大鼠原肌球蛋白1表达水平不存在显著差异（P ＞0.05）。见图4。

2.5 3组受试大鼠细胞分裂素活化蛋白激酶1 表达水平比较 糖尿病抑郁组受试大鼠细胞分裂素活化蛋白激酶1 表达量明显低于对照组及糖尿病组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组与糖尿病组受试大鼠细胞分裂素活化蛋白激酶1 表达水平不存在显著差异（P＞0.05）。见图5。

2.6 3组受试大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表达水平比较 糖尿病抑郁组受试大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表达量明显低于对照组及糖尿病组，差异具有统计学意义（P＜0.05）；对照组与糖尿病组受试大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表达水平不存在显著差异（P＞0.05）。见图6。

图2 3 组受试大鼠旷野试验水平、垂直得分比较Fig.2 Comparison of field test and vertical score between the rats

图3 受试大鼠钙网织蛋白前体表达水平比较Fig.3 Comparison of expression levels of calreticulin precursor in the rats

图4 受试大鼠原肌球蛋白1 表达水平比较Fig.4 Comparison of tropomyosin 1 expression in the rats

图5 3 组受试大鼠细胞分裂素活化蛋白激酶1 表达水平比较Fig.5 Comparison of the expression levels of cytokinin kinase 1 in three groups of rats

3 讨论

当前的研究指出，糖尿病和抑郁症两者共病导致临床结局变得更差。同时患有糖尿病和抑郁症这两种疾病的患者出现疾病相关并发症的可能性，比只患其中一种疾病的患者高出2 倍。因为另一种疾病的存在，导致两种疾病的预后都变得更差，包括疾病的严重程度，治疗抵抗率和病死率增加，个体和社会的治疗花费明显上升，生存质量和糖尿病自我管理能力下降，并发症发生率提高，以及预期寿命减少。

图6 3 组受试大鼠活化分裂素蛋白激酶1 表达水平比较Fig.6 Comparison of expression levels of activin splice kinase 1 in three groups of rats

抑郁症是由多基因、多因素等共同导致的疾病，目前尚未发现单一的抑郁症致病基因以及固定的遗传模式［5-6］。近年来，随着对抑郁症研究的不断深入，研究人员已经发现多种抑郁症易感基因，然而部分基因所编码的蛋白产物的作用尚未明确。当前蛋白质组的三大研究热点包括脑蛋白组、血液蛋白质组以及肝脏蛋白质组，上述也领域是国内外研究的难点于薄弱环节。由于蛋白质具有翻译调控以及翻译后修饰等功能，蛋白组学可对转录组学以及基因组学的缺陷进行有效弥补，相对于基因组学来说，蛋白组学能够提供更多的信息，并可对基因功能进行直接揭示。蛋白质作为基因的最终编码产物以及药物的直接作用靶点，其相关研究对抑郁症等多种疾病的早期诊断、治疗以及预后评估方面意义重大，“抑郁蛋白”有望开启抑郁症治疗的新思路［7-10］。

研究显示，在抑郁症的发病机制的发生发展过程中海马扮演着重要角色［11］。MRI 及尸检结果均已显示，抑郁症患者的海马体积相对较小；研究人员通过动物试验发现，抑郁动物的糖皮质激素水平上升，能够通过使得神经营养因子水平降低，最终发挥兴奋性毒性作用，引起海马神经发生降低。此外，另有研究证实，大鼠海马神经发生可与抗抑郁药物治疗后出现增加，以X 线对药物诱导的神经发生进行阻断后，动物的抑郁行为会随之复发。上述结论均表明，抗抑郁药物改变抑郁行为通过对海马的神经发生进行刺激以实现的，但目前仍尚未明确抑郁症的致病以及抗抑郁药物作用过程相关的蛋白包括哪些。

研究人员为健康大鼠应用抗抑郁药物氟西汀并对其海马蛋白组学进行分析，发现用药后大鼠神经发生相关蛋白表达发生显著变化。钙网织蛋白前体与神经发生相关，属于生长发育调节蛋白之一与蛋白合成及维护、肿瘤细胞的生长及侵袭等过程相关；细胞分裂素活化蛋白激酶参与神经系统的发育过程中的神经发生及神经分化，研究表明细胞分裂素活化蛋白激酶与神经炎症过程中轴突运输以及构建神经微丝相关，其水平异常可能会造成神经变性，研究发现其在家族性多发性神经病患者体内表达水平降低［12-14］。原肌球蛋白1 表达水平异常与非小细胞肺癌、膀胱移行细胞癌等疾病相关［15］。本研究通过构建自发性糖尿病抑郁大鼠的UCMS 模型，经测定发现糖尿病抑郁组受试大鼠旷野试验水平得分、垂直得分均明显低于对照组及糖尿病组，提示抑郁模型构建成功；采用ELISA 法测定上述4 种蛋白表达水平发现，自发性糖尿病抑郁大鼠海马组织中钙网织蛋白前体、原肌球蛋白1、细胞分裂素活化蛋白激酶1 和活化分裂素蛋白激酶1 表达量均明显低于健康大鼠及糖尿病大鼠，提示大鼠抑郁行为与上述4 种蛋白表达水平降低有关。本研究的创新点是发现，可以通过神经发生相关蛋白反映抑郁症的发病进展情况。本研究的不足之处是，虽然从本研究结论能够推断出海马神经发生相关蛋白含量降低于抑郁症的发病具有一定的相关性，但仍有其他因素可能与该症的发病相关，如例糖皮质激素水平上升对大脑皮层、海马以及皮层下区域产生直接毒性作用等［16-18］，这也是本课题组进一步的研究方向。

综上所述，自发性糖尿病大鼠的抑郁症行为与大鼠海马组织中钙网织蛋白前体、原肌球蛋白1、细胞分裂素活化蛋白激酶1、活化分裂素蛋白激酶1 表达水平下降相关。