肺癌晚期患者不同基因突变、融合或扩增的相关性

姚源山 周银杰 杨振华 华青旺 沈海波

宁波市第二医院胸外科（浙江宁波315000）

近年来肺癌的发病率和病死率逐步上升，据中国国家癌症中心2015年数据，我国肺癌发病率、病死率在各癌种中均居首位［1］。已证实肺癌与吸烟之间存在关联，但越来越多的证据已经指向遗传易感性介导，因此分子学检测与归类可以进一步标准化治疗方案。根据近期一个100 份NSCLC 肿瘤样本的全外显子测序报告，其中包括测试编码表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）基因和BRAF 基因V600E 的突变，寻找间变性淋巴瘤激酶（anaplasticlymphoma kinase，ALK）和大鼠骨肉瘤（ratosteosarcoma，ROS7）编码基因的易位，以及新近添加的评估程序性死亡受体配体1（programmed death-1，PD-L1）的表达等［2］。目前分子靶向治疗是临床研究的热点，而以往的靶点研究只注重单个基因的突变、扩增或融合，然而疾病的发生往往非单一因素，多个基因之间具有一定的相关性，本研究进一步深入的探讨基因之间的关联性，现报告如下。

1 资料与方法

1.1 诊断标准 根据燃石朗克TM基于第二代测序技术与南京世和基因生物技术有限公司主研发的Lung Trak panel，检测NCCN 指南中明确与非小细胞肺癌个性化治疗方案高度相关的基因突变、重排及拷贝数变化。

1.2 纳入及排除标准 经病理学诊断确诊为NSCLC 患者，细胞块标本来源于胸水、血液、血浆，组织块标本来源于肺穿、胸膜和手术标本。

1.3 一般资料 收集我院信息系统（HIS）院病理科进行基因检测的NSCLC 患者共630 例患者，男430 例，年龄20 ～86 岁，平均（53.46 ± 13.12）岁，中位年龄60 岁；女200 例，平均（56.36±16.64）岁，中位年龄56 岁。

1.4 数据提取及预处理 利用SQL Server 管理工具从浙江宁波市第二医院临床数据库中将入选患者的住院病历的全部数据进行提取、转换，建立新的数据库。将EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、RET、ROS1、KRAS 等8 个NCCN 指南中明确与非小细胞肺癌个性化治疗方案高度相关的以及重复出现的基因按突变、扩增、及融合排序分析。

1.5 统计学方法及数据挖掘 （1）采用Excel 2016建立数据库，分析不同基因以及突变、扩增及融合频率，归纳总结规律。（2）患者核心基因情况采用复杂网络技术，根据基因出现配伍网络中的节点度以及节点配伍的权重分布，发现处方配伍网络的核心节点及其配伍。（3）关联规则分析采用IBM Modeler 14.2 中的Apriori 模块为挖掘工具来探讨基因之间的关系，置信度为50%，支持度设置为10%。（4）利用SPSS 22.0 软件进行统计分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 630例NSCLC患者前26位基因情况 高频率出现的有26 位基因（表1）。其中EGFR-19 突变、ALK 融合、RET 突变、EGFR-L858R-21 突变、ALK 突变、T790M 突变为前6 位（图1）；前26 位中NRASG12D 突变与BRAF-G466V 突变、MYC-R450W 突变与CYP2D6 突变、GATA3M423fs 突变与ESR1 突变、SRC 突变与GATA3M423fs 突变、SRC 突变与ESR1突变分类值之间共现频率网络图形具有，见图2。

表1 630 例NSCLC 患者前26 位基因情况Tab.1 The first 26 genes in 630 patients with NSCLC

图1 前6 位突变分类值频率网络图Fig.1 Frequency network diagram of the first six mutation classification values

图2 前26 位突变分类值频率网络图Fig.2 Frequency network diagram of the first 26 mutation classification values

2.2 基因关联分析 设置最小为50%，支持度设置为10%，经Apriori 模块分析，以支持度排名取值，见表2。

表2 药物二相关联规则分析Tab.2 Analysis of two phase association rules of drugs

2.3 基因聚类分析 一般认为同类样本之间距离越小，不同类样本之间距离越大。本文使用系统聚类方法针对频率前26 位进行聚类分析，见图3。基因聚类结果分析，见表3。

图3 基因系统聚类树状图Fig.3 Cluster dendrogram of gene system

表3 基因聚类结果分析Tab.3 Analysis of genetic clustering results

3 讨论

有研究［3］表明肺癌化疗效果及预后生存可能与相关基因变异及表达水平有关，近年来相关研究已经取得了重大突破，某个基因的缺失、突变、扩增以及融合与肺癌发病率明显相关，不同基因型的晚期NSCLC 患者的预后差异也较大［4-5］。因细胞毒药物应答与单个基因标志物的相关性较弱，因此首先寻找基因之间的关联性可以联合用药提高疗效及预后生存［6］。高频率出现的有26 位基因与SHAW 等［7］通过对马萨诸塞总医院650 例肺腺癌患者进行筛查得到的结果基本一致，基因分型检测出在KRAS ＞EGFR ＞PI3K ＞HER2 ＞BRAF ＞AKT ＞NRAS。此外，荧光原位杂交技术被用来鉴定涉及ALK 或ROS 的染色体重排，以及c-MET 基因扩增。

本研究将EGFR、ALK、ERBB2、BRAF、MET、RET、ROS1、KRAS 等8 个基因通过共现频率网络图形发现，BRAFG464V 突变与KRAS G12A 突变、KRAS G12D突变，ERBB2 S310F突变与KRAS G12D突 变，BRAF-G466V 突 变 与ERBB2 S310F 突 变、KRAS G12A突变、KRAS G12D突变，具有关联性，因此临床靶向用药时可重点排查和预防。BRAF突变多见于女性、肺腺癌患者，BRAF突变或融合基因的NSCLC 可能对BRAF 抑制剂和MEK 抑制剂敏感［8］。但携带BRAF 基因突变的肿瘤可能对选择性BRAF抑制剂不敏感。KRAS 突变的NSCLC 患者的预后差，是肺癌独立的预后因子［9］。携带KRAS 突变的肿瘤可能对EGFR、BRAF、MET、ALK 等靶点抑制剂耐药，但可能对MEK 抑制剂和CDK4∕6 抑制剂敏感。BRAF 突变与KRAS 突变关系与相关报道一致［10］。ERBB2突变，可作为评价肺腺癌和鳞癌恶性程度、淋巴结转移潜能及预后的有效指标之一，而晚期NSCLC 对ERBB2 抑制剂敏感［11］。前26 位中NRAS-G12D 突 变 与BRAF-G466V 突 变、MYCR450W 突变与CYP2D6 突变、GATA3M423fs 突变与ESR1 突变、SRC 突变与GATA3M423fs 突变、SRC 突变与ESR1突变分类值之间具有关联性。

根据基因关联分析结果，可知EGFR-19突变与14 基因缺失，EGFR-19 突变与T790M 突变，EGFR-19 突变与TP53 突变，ROS1 融合与MET 扩增，MET扩增与ROS1融合，T790M突变与EGFR扩增，EGFR-19 突变与EGFR 扩增，支持度以此降低。EGFR 基因与其他基因的关联性密切，因此在针对其他基因靶向用药是应该注重EGFR 基因的导向性。（NCCN®）肿瘤临床实践指南指出，携带某些EGFR突变的肿瘤对一∕二代EGFR-TKI 敏感。携带某些EGFR 突变的肿瘤可能对一∕二代EGFR-TKI 耐药，但对三代EGFR-TKI 敏感。研究显示［12］，T790M 突变是在TKI 长期治疗过程中保留下的基因改变，它在疾病进展前6个月到进展后4个月表达阳性率进行性升高，同时伴有EGFR 敏感突变（19 外显子缺失或21外显子L858R）阳性率的大幅增加。杜亚茜等［13］研究发现，EGFR基因突变多见于有TKI用药史且服药时间＞6个月的晚期NSCLC患者。携带EGFR20 号外显子插入突变的肿瘤可能对现有EGFRTKI 都不敏感，针对性TKI 正在早期研发中。携带EGFR扩增的肺鳞癌可能对抗-EGFR抗体敏感。因此在关联基因同时靶向用药可能会降低对一∕二代EGFR-TKI耐药将是后期的研究方向。

本文使用系统聚类方法针对频率前26 位进行聚类分析，聚类结果有9 组，有研究发现黑色素瘤细胞内BRAF 和NRAS mRNA 量和蛋白表达量与细胞增殖呈正相关性［14］。MET 扩增与ROS1 融合在以往的临床极少发现，但并不完全排除共存，朱卫 东等［15］发现1 例患者 同 时存 在MET 扩 增 和ROS1 基因重排，这与本研究结果一致。BRAF 是EGFR 下游信号转导通路中的重要信号分子，联合检测NSCLC 肿瘤组织EGFR 与BRAF 可对筛选EGFR-TKI 受益人群有帮助。

本次回顾性研究具有一定的局限性，如例数太少、统计误差等，或许还有更多相关性基因由于例数少未显示出来，但临床发病往往非单一因素，本研究通过计算机辅助分析的结果具客观性，为临床用药提供了参考，具有一定的指导价值。