黄嘌呤氧化酶在激素诱导成骨细胞凋亡过程中的作用及机制*

黄冠予 彭昊* 刘阳 张雷 梁世博

股骨头缺血性坏死（osteonecrosis of the femoral head，ONFH）是一种常见的难治性骨科疾病。ONFH可大致分为两类：一类为创伤引起的股骨头缺血性坏死，称为创伤性ONFH；另一类为非创伤因素引起的股骨头缺血性坏死，称为非创伤性ONFH。其中，创伤性ONFH的发病原因通常较为明确，大多是因为外伤引起的股骨头滋养血管（尤其是旋股内侧动脉）受损，引起股骨头血供不足，导致股骨头中骨细胞缺血性坏死。非创伤性ONFH的发病原因则通常比创伤性ONFH复杂，大致包括以下原因：长期或大剂量使用糖皮质激素；大量饮酒；肥胖；血液系统疾病；潜水病；类脂质增生；血管疾病；结缔组织病；肾移植；急性胰腺炎。其中，长期或大剂量使用糖皮质激素和酗酒是非创伤性ONFH最主要、最常见的两个发病原因。

目前，糖皮质激素作为治疗某些自身免疫性疾病（如肾病综合征、系统性红斑狼疮及类风湿性关节炎等）的有效手段，其使用率在不断增长，因此导致了糖皮质激素引起的ONFH的患者数量不断增多[1-2]。长期接受糖皮质激素治疗的患者9%～40%会发生激素性骨坏死（glucocorticoidinducedosteonecrosis，GIO），而短期大剂量的糖皮质激素的暴露也会发生骨坏死[3-4]。糖皮质激素诱导的股骨头缺血性坏死的病理机制十分复杂，受到广泛认同的观点包括：脂质代谢紊乱；血液循环障碍；髓内压升高；凝血纤溶系统障碍；微血管内皮损伤；细胞功能障碍；细胞凋亡[5-9]。地塞米松作为糖皮质激素中的代表药物，被广泛用于临床治疗及基础实验研究中。现今，国内外学者的研究重心逐渐集中于细胞凋亡学说。国内外多项研究表明，激素性ONFH的病理进程中包含了成骨细胞的凋亡。而且激素性 ONFH的实质并非是骨细胞的坏死，而是表现为成骨细胞的显著凋亡[10-12]。在激素诱导的成骨细胞凋亡过程中，氧化损伤要早于骨坏死，使用激素后，很快就会出现氧化损伤。糖皮质激素会使得小鼠骨组织内活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）生成增加[13]。LinH和SatoAY等学者[14-15]的研究也证实，ROS与激素诱导的成骨细胞凋亡具有紧密的联系。

黄嘌呤氧化酶（xanthineoxidase，XOD）是一种底物专一性低，并且广泛存在于各类动物组织细胞的酶。其主要作用包括：参与机体内核酸的分解代谢；促进铁的吸收与转运；检查超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）的活性；产生氧自由基。黄嘌呤氧化酶是大多数细胞胞质内ROS的主要来源之一。在外界压力增大的情况下，XOD活性增加导致细胞内ROS增多，ROS的剧烈增多导致了细胞内损伤的发生及亚细胞结构的改变。多项国内外研究表明，XOD高表达和活性增加导致细胞内的ROS增加，从而导致了细胞凋亡[16-18]。但从现有文献看，对XOD和细胞凋亡关系的研究大多集中在心肌细胞、肺泡上皮细胞及肿瘤细胞领域。并未有文献报导在激素性成骨细胞凋亡过程中XOD所起到的作用以及具体的信号传导通路。因此，本实验旨在探究在糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡的病理过程中，XOD的具体作用以及作用机制。并通过使用XOD的特异性抑制剂别嘌醇进行干预，以期阐述具体的信号调控通路以及调控机制，寻找到新方法治疗ONFH。

1 材料与方法

1.1 细胞及主要试剂

实验细胞为小鼠胚胎成骨细胞前体细胞（MC3T3-E1），由中科院细胞库提供。主要试剂包括：胎牛血清（Serapro公司）、别嘌醇（Selleck公司）、地塞米松（Sigma公司）、STAT-1抗体（Sigma公司）、Caspase-3抗体（Sigma公司）、Bcl-2抗体（Sigma公司）、Bax抗体（Sigma公司）、细胞内ROS检测试剂盒（红色荧光，Sigma公司）、黄嘌呤氧化酶试剂盒（Sigma公司）、JC-1试剂盒（Sigma公司）、MDA试剂盒（Sigma公司）。

地塞米松（Dexamethasone，DEX）原液：25 mg DEX粉末加入25 mL无水乙醇中混匀。

1 mg/mL别嘌醇原液：25 mg别嘌醇粉末加入25 mL PBS溶解混匀。

5mol/L别嘌醇DEX培养基：34L别嘌醇原液与15 mL的110-6mol/L DEX培养基混匀。

10 mol/L别嘌醇DEX培养基：68 L别嘌醇原液与15 mL的110-6mol/L DEX培养基混匀。

15mol/L别嘌醇DEX培养基：102L别嘌醇原液与15 mL的110-6mol/L DEX培养基混匀。

1.2 激素性成骨细胞凋亡模型的建立

1.3 CCK-8试剂盒

使用 CCK-8试剂盒检测在糖皮质激素诱导的条件下，加入不同浓度的别嘌醇时，细胞存活百分比。药物浓度分别选取 0、3、5、7、10、13、15、20 mol/L。

1.4 实验分组及干预方法

1.5 生化指标测定

通过 CCK-8试剂盒检测合适的干预药物浓度。流式细胞仪检测细胞凋亡情况以及细胞内ROS荧光强度。全自动荧光显微镜拍摄细胞内ROS荧光照片，并测算平均荧光密度。Western Blot检测凋亡相关蛋白表达情况。试剂盒检测细胞内XOD、MDA以及线粒体膜电位（mitochondrialmembrane potential，MMP）。

1.6 统计学方法

本次实验数据均使用SPSS21.0软件进行统计学分析，所有的计量资料以均数±标准差表示。使用单因素ANOVA分析进行多组数据之间的比较，多组数据间的两两比较则使用Bonferroni法校正检验结果。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CCK-8试剂盒检测细胞活力

CCK-8试剂盒的检测结果显示，在DEX诱导凋亡的背景下，别嘌醇药物浓度小于5 mol/L时，没有显著的保护作用。当别嘌醇药物浓度大于5 mol/L且小于15 mol/L时，细胞存活率随着药物浓度增加而增加。当别嘌醇浓度超过15 mol/L时，细胞存活率无明显增高。根据CCK-8试剂盒各组吸光度结果，测算出各组细胞存活率后，用 GraphPad Prism-5软件制作曲线图并测算半最大效应浓度（concentration for 50%of maximal effect，EC50），得出的EC50值为8.898mol/L，因此本次实验设置的浓度梯度为5 mol/L、10 mol/L和15 mol/L，见图1。

图1 在DEX诱导凋亡的背景下，不同别嘌醇浓度时的MC3T3-E1细胞活力

2.2 流式细胞仪（FCM）检测MC3T3-E1细胞凋亡情况

结果显示，在凋亡细胞占比方面，空白组为（5.96±0.446）%，模 型 组 为（12.86±1.671）%，5 mol/L 组 为（8.94±0.340）%，10 mol/L组为（7.94±0.079）%，15 mol/L组为（6.88±0.129）%。通过单因素ANOVA分析，发现空白组与模型组、5 mol/L组、10 mol/L组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）；而空白组与15 mol/L组相比，差异无统计学意义（P=0.192）。模型组与空白组以及其他各干预组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图2）。

图2 A.空白组；B.模型组；C.5 mol/L组；D.10 mol/L组；E.15 mol/L组（n=6）

2.3 流式细胞仪（FCM）检测细胞内ROS荧光强度

结果显示，空白组ROS平均荧光强度为（16618.33±817.377）；模型组ROS平均荧光强度为（39 449.67±1 532.136）；5 mol/L组ROS平均荧光强度为（32688.33±1484.619）；10 mol/L组ROS平均荧光强度为（28091.00±1434.407）；15 mol/L组ROS平均荧光强度为（23639.67±1221.545）。空白组与其他各组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。通过Bonferroni法校正，两两对比结果显示各组细胞内ROS的平均荧光强度差异有统计学意义（P＜0.05，见图3）。

图3 A.各组细胞内ROS荧光强度分布图（n=6）；B.各组细胞内ROS平均荧光强度（P＜0.05，n=6）。**代表与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）

2.4 荧光显微镜检测ROS荧光平均光密度

通过荧光显微镜对各组细胞的细胞爬片进行拍照记录，通过计算细胞ROS荧光平均光密度对比各组细胞中ROS含量。通过 ImageJ软件分析，空白组 ROS平均光密度为（0.052±0.0020），模型组 ROS 平均光密度为（0.130±0.0040），5 mol/L组ROS平均光密度为（0.093±0.0015），10 mol/L组ROS平均光密度为（0.077±0.0025），15mol/L组ROS平均光密度为（0.063±0.0025）。通过单因素ANOVA分析，空白组的ROS平均光密度与其他各组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。各组间进行两两比较，各组的平均光密度数值差异有统计学意义（P＜0.05）（见图4）。

图4 A.各组细胞的ROS荧光照片，由左至右分别为整合图、ROS荧光图和未氧化的二氢乙啶荧光图；B.各组细胞内ROS平均荧光密度。**代表与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）

2.5 Western Blot技术检测细胞内蛋白表达

结果显示，模型组与空白组相比促凋亡蛋白明显表达增加，如Caspase-3、STAT-1、Bax，而抗凋亡蛋白Bcl-2明显降低，通过单因素 ANOVA分析显示差异有统计学意义（P＜0.05）。5 mol/L组、10 mol/L组、15 mol/L组与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。随着别嘌醇浓度的增加，STAT-1、Caspase-3和 Bax的表达量逐渐下降，而Bcl-2的表达量显著上升（见图5）。

图5 A.各组细胞Western Blot蛋白条带图（n=6）；B.各组细胞中STAT-1、Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白的蛋白印迹灰度值与内参蛋白GADPH灰度值的比值（n=6）。**代表与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）

2.6 黄嘌呤氧化酶试剂盒检测细胞内黄嘌呤氧化酶（XOD）表达

结果显示，空白组的 OD值为（0.161±0.0113）A，模型组的OD值为（0.243±0.0144）A，5mol/L组的OD值为（0.166±0.0174）A，10 mol/L 组的OD值为（0.138±0.0150）A，15mol/L组的 OD 值为（0.113±0.0125）A。单因素ANOVA分析结果表明模型组与空白组进行比较，差异有统计学意义（P＜0.05），通过两两比较发现，空白组和5 mol/L组之间差异无统计学意义，5 mol/L组和10 mol/L组比较差异无统计学意义（P≥0.05），其他各组间两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图6）。

2.7 JC-1试剂盒检测MMP

结果显示，空白组JC-1阳性细胞比例为（4.76±0.633）%，模型组JC-1阳性细胞比例为（15.31±1.262）%，5 mol/L组 JC-1阳性细胞比例为（9.16±0.419）%，10 mol/L组JC-1阳性细胞比例为（8.11±0.577）%，15 mol/L组 JC-1阳性细胞比例为（7.57±0.631）%。通过单因素ANOVA分析，模型组与空白组相比较差异有统计学意义（P＜0.05），同时各个别嘌醇干预组与模型组和空白组相比较差异有统计学意义（P＜0.05）。可见在模型组中JC-1阳性细胞比例显著上升，即MMP降低的细胞所占比例明显上升。随着别嘌醇的浓度增高，JC-1阳性细胞比例有所降低，但仍高于空白组（见图7A）。各组 FL2阳性细胞与 FL1阳性细胞的比值（见图7B），通过单因素ANOVA分析，空白组、模型组与各别嘌醇干预组组间比较差异有统计学意义（P＜0.05）。别嘌醇干预组组间两两比较，差异无统计学意义（P≥0.05）。

图6 各组细胞胞质内XOD的OD值（n=6）。**代表与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）

图7 A.右上象限代表FL1阳性细胞（即JC-1阳性细胞），右下象限代表FL2阳性细胞（即JC-1阴性细胞）（n=6）；B.各组FL2阳性细胞与FL1阳性细胞的比值（n=6）。**代表与空白组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）

2.8 MDA试剂盒检测细胞内脂质过氧化作用

本实验中，空白组MDA含量为（1.18±0.126）nmol/mL，模型组 MDA 含量为（4.47±0.277）nmol/mL，5 mol/L 组MDA含量为（3.24±0.192）nmol/mL，10 mol/L组MDA含量为（2.29±0.297）nmol/mL，15mol/L 组 MDA 含量为（2.19±0.185）nmol/mL。通过单因素ANOVA分析，模型组细胞内 MDA含量与其他各组相比，差异有统计学意义（P＜0.05）。10 mol/L组与15 mol/L组相比，差异无统计学意义（P≥0.05）。其他各组间进行两两比较，差异有统计学意义（P＜0.05）（见图 8）。

图8 各组MC3T3-E1细胞胞质内MDA含量（n=6）。**代表与空白组相比，差异有统计学意义

3 讨论

糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡是激素性 ONFH的病理实质，但因其细胞内的信号转导通路十分复杂，因此仍旧是研究的热点。在糖皮质激素诱导成骨细胞凋亡的病理过程中，氧化应激损伤、黄嘌呤氧化酶、ROS是否参与到了病理过程以及是否促进成骨细胞凋亡，至今仍未被明确阐述。在本次实验中，干预组加入了不同剂量的别嘌醇，目的是抑制细胞中XOD的活性，减少MC3T3-E1细胞内ROS的生成，降低 MC3T3-E1细胞所受到的氧化应激损伤和细胞凋亡比例。XOD是细胞内ROS的主要来源之一，当细胞受到外界刺激损伤时，细胞通过半胱氨酸残基介导的可逆性氧化或Ca2+介导的不可逆性氧化途径使得蛋白质水解，使得更多的黄嘌呤脱氢酶（xanthine dehydrogenase，XDH）转变为XOD，而XOD在参与细胞内氧化还原反应时，会将电子转移至氧分子上，从而产生大量ROS[19]。

本实验中使用别嘌醇抑制XOD后，细胞凋亡比例与模型组相比明显降低，说明抑制XOD活性可以抑制DEX诱导的MC3T3-E1细胞凋亡。在细胞内ROS含量方面，模型组ROS荧光强度以及平均光密度明显高于其余各组，表明在糖皮质激素诱导的 MC3T3-E1细胞凋亡的过程中，细胞内ROS浓度明显增加，而抑制XOD活性后，可以减少细胞内ROS的产生和积累，缓解细胞氧化应激损伤。在使用不同剂量别嘌醇干预后，细胞内ROS的荧光强度以及平均光密度显著降低，细胞凋亡比例也有所降低。再次说明XOD和ROS均参与了激素性成骨细胞凋亡的病理过程，并且有促凋亡的作用；而通过抑制细胞内XOD的活性，可以减少MC3T3-E1细胞内ROS的产生，从而减少细胞凋亡的比例。在 Guo F等学者对 HCT116细胞凋亡过程的研究中发现，ROS通过诱导MMP降低，使线粒体膜通透性增加并且增加Caspase-3、Bax等促凋亡蛋白的表达上调，抗凋亡蛋白Bcl-2下调，从而促进细胞凋亡过程[20]。Lee MH等学者[21]的研究也表明ROS可以通过线粒体途径诱导细胞凋亡，其机制与线粒体膜通透性增高后，线粒体释放细胞色素 C并引起下游的胱天蛋白酶（caspase）产生级联反应有关。本次实验中，WesternBlot的结果显示，模型组中促凋亡蛋白STAT-1、Caspase-3和Bax的表达明显上调，而STAT-1是Caspase-3上游的调控因子，可以说明糖皮质激素通过激活 STAT-1/Caspase-3信号通路途径和调节 Bax/Bcl-2比例来诱导MC3T3-E1细胞凋亡。结合WesternBlot的结果和JC-1检测结果可以发现，糖皮质激素可以通过上调Bax蛋白表达，下调Bcl-2蛋白表达，使得Bax转位至线粒体外膜并形成多聚体孔道，造成线粒体膜通透性增加和MMP稳态崩溃，线粒体膜间隙内的促凋亡物质被释放入细胞基质内，触发内源性线粒体促凋亡途径，导致细胞凋亡。在别嘌醇干预组中STAT-1、Caspase-3和Bax蛋白表达与模型组相比显著降低，Bcl-2的表达上调，说明ROS可以通过STAT-1/Caspase-3信号通路途径以及调节Bax/Bcl-2比例来诱导MC3T3-E1细胞凋亡。而别嘌醇可以通过抑制过量ROS的产生，减少STAT-1、Caspase-3和Bax蛋白表达，效果与剂量呈正相关，可以再次证明ROS是通过STAT-1/Caspase-3信号通路途径以及调节Bax/Bcl-2比例来诱导MC3T3-E1细胞凋亡的。但是在不同剂量的别嘌醇干预组中，Bcl-2蛋白表达与模型组相比有所上调，但与药物剂量未见显著正相关联系，可能是由于别嘌醇不是Bcl-2的特异性激动剂，而是通过降低ROS的产生来降低线粒体膜的氧化应激损伤。在 Zhong J等学者[22]对SH-SY5Y细胞的研究中，他们发现通过抑制ROS的生成可以扭转部分细胞膜电位的降低，并且减少Caspase-3和Bax蛋白的表达，从而抑制SH-SY5Y细胞凋亡。另一项对表柔比星诱导成骨细胞凋亡的研究中也表明，过量的ROS可以通过上调Caspase-3和Bax蛋白的表达，下调Bcl-2的表达导致成骨细胞通过内源性线粒体途径凋亡[23]。

本次实验中，模型组中细胞XOD的活性明显高于其他各组，且氧化应激损伤导致的膜脂质过氧化反应程度也显著高于其他各组，说明XOD和氧化应激反应参与到了该病理过程中。XOD在此过程中产生大量ROS，并且超出细胞自身清除ROS的能力范围，导致细胞凋亡。从别嘌醇干预组的结果来看，加入特异性XOD抑制剂别嘌醇可以有效地抑制XOD的活性，减少ROS的产生并降低氧化应激损伤，从而减少由ROS介导的线粒体途径细胞凋亡。结合MMP检测结果来看，在此过程中MMP下降并失稳，说明在此过程中ROS起到关键的作用，ROS通过介导对线粒体的氧化应激损伤，导致线粒体膜通透性增高和膜电位稳态失衡。通过别嘌醇干预，MMP降低细胞占比有所减少。其原因可能是因为过量ROS是导致MMP崩溃的主要诱因，而别嘌醇可以减少ROS的生成，从而减少线粒体的氧化应激损伤。在LiK等学者的研究中，使用ROS清除剂N-乙酰半胱氨酸可以显著减少硝普钠诱导的椎间盘髓核细胞的凋亡，其原理是通过清除ROS使得MMP恢复稳定，从而减少内源性线粒体途径所致的细胞凋亡[24]。在Jacob S等学者的研究中发现，使用特异性XOD抑制剂非布司他可以有效抑制气管上皮细胞的氧化应激损伤，显著降低细胞内XOD活性，减少ROS和MDA的含量[25]。

4 结论

XOD在激素性成骨细胞凋亡的病理过程中，产生过量的 ROS，引起细胞氧化应激损伤，并通过激活 STAT-1和Bax来诱导细胞凋亡，并且还可以导致MMP稳态崩溃诱发内源性线粒体凋亡途径。而别嘌醇可以特异性地抑制 XOD的活性，减少细胞内ROS的产生，减少STAT-1、Caspase-3和Bax蛋白表达，使细胞MMP稳态恢复，从而减少成骨细胞凋亡。