载万古霉素MSNs复合硫酸钙制备人工骨的缓释与抗菌作用研究*

顾继生 蔡晓冰* 朱明 刘涛 邱水强 罗振东 陈强 徐志刚

开放性骨折是创伤骨科的常见病、多发病，因为存在断端污染和骨缺损，加之皮肤软组织损伤，血运障碍，术后易发生并发感染和骨折不愈合，导致感染性骨缺损[1]，一旦转变为慢性创伤后骨髓炎，临床治疗将更加复杂[2-3]。骨移植是治疗骨缺损的关键，骨移植一般都要求在植骨处为无菌条件，开放性骨折和慢性骨髓炎导致的感染性骨缺损，一期植骨极易引起感染加重，伤口迁延不愈，窦道形成，手术失败，甚至会造成如截肢等灾难性的后果[4]。由于全身应用抗生素难以在局部形成较高的抗生素浓度并存在诸多不良反应，目前，治疗开放性骨折及慢性骨髓炎多采用填充人工骨材料并予以局部应用抗生素，常用的骨植入材料包括不可吸收的PMMA和各类可吸收的人工骨材料（如硫酸钙、羟基磷灰石等），可吸收的植入材料由于不需要行二次手术取出，可任意塑形，并可以加载抗生素及各类活性物质，同时诱导骨形成，在骨感染治疗上具有较大优势。然而，这类骨植入材料负载抗生素后普遍存在抗生素局部释放持续时间短的弱点，难以长时间持续抑菌。

介孔二氧化硅纳米颗粒（mesoporous silica nanoparticles,MSNs）作为一种新型载药材料，具有均一的孔径、规则的孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的内外表面、巨大的比表面积等优点[5]，可以有效延长药物的释放时间[6]。目前基于MSNs的缓释药物递送系统主要有纯MSNs和修饰后的MSNs两类，MSNs表面未经修饰仅通过调节介孔结构的孔径便可实现药物的持续释放，而经过不同的表面基团修饰，可以对不同药物产生缓释作用。本研究采用的是经有机硅烷对MSNs进行表面修饰后得到的缓释系统。硫酸钙作为骨植入修复材料已有近百年历史，也在临床上取得较好疗效[7-8]。结合两者的优势，有望获得一种局部缓释持续时间更久的抗生素释放系统。在骨感染病例中，最常见的致病菌为金黄色葡萄球菌，且易产生耐药，而万古霉素目前较少耐药，多作为感染性骨缺损、慢性骨髓炎治疗的首选药物[9]。但万古霉素经由该系统释放后是否降低了抗菌效能尚未可知。

本实验采用硫酸钙复合介孔二氧化硅负载万古霉素制备的人工骨材料在体外研究该人工骨对万古霉素的缓释作用及抗菌效能，为其进一步应用提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料和仪器

盐酸万古霉素粉剂（日本），载万古霉素的 MSNs（复旦大学高分子聚合物实验室制备），医用硫酸钙（天津希恩思生化科技有限公司），Nanodrop2000微量紫外分光光度计（Thermo），离心机（Thermo），恒温培养箱（Thermo），超净工作台（海尔），滤纸片（walkman），金黄色葡萄球菌（ATCC25923，同济大学附属第十人民医院检验科），移液器（上海大龙）。

1.2 实验方法

1.2.1 抗生素释放试验

制备载万古霉素质量分数为5%的万古霉素-介孔二氧化硅纳米颗粒-硫酸钙（Van-MSNs-CaSO4）作为实验组，同时制备载万古霉素-硫酸钙（Van-CaSO4）人工骨作为对照组（见图1）。紫外线照射灭菌备用。实验分为四组，均按0.1 g/mL比例浸泡于PBS溶液中，37℃恒温浸提。其中实验组一（S1）和对照组一（C1）按不同时间点全量更换新鲜PBS溶液，实验组二（S2）和对照组二（C2）按不同时间点半量更换新鲜PBS溶液。收集各组浸提液，2 000转，2 min离心，取上清液于280 nm波长测定各组吸光度，绘制万古霉素标准曲线，分别计算两种人工骨浸提液中的万古霉素含量，并将浸提液于-20℃冰箱保存备用。

1.2.2 抑菌试验

制作直径6 mm的圆形空白滤纸片，环氧乙烷灭菌备用。从孵育24 h的血琼脂平板上，挑取3～5个菌落，制成悬液作为接种，然后将浊度调整至0.5麦氏比浊标准，用无菌棉签蘸取菌液在管壁上挤去多余菌液，涂布整个M-H琼脂平板表面，反复4次，每次将平板旋转90°，保证涂布均匀。分别不同时间点人工骨浸提液30 L滴加入空白滤纸片，将滤纸片贴服于上述涂布细菌的M-H琼脂上，置37℃恒温培养箱培养24 h，测量抑菌圈直径。

2 结果

2.1 抗生素释放试验

图1 A.通过吸光度计算万古霉素浓度；B.全量及半量更换浸提液组在不同时间点检测的万古霉素浓度

线性方程：Y=2.456X+0.005(Y：万古霉素浓度；X：Nanodrop 2000紫外分光光度计吸光度)

由图1可以看出，不同时间点全量更换PBS组，实验组抗生素浓度始终高于对照组；半量更换PBS组，抗生素浓度峰值明显延迟，并在检测时间段内始终大于最低抑菌浓度。

2.2 抑菌试验（见表1，图2）

表1 不同时间点测得的浸提液抑菌环直径

图2 不同时间点测得的抑菌环直径

3 讨论

硫酸钙用作骨移植材料填充骨缺损历史悠久。在骨感染病例中，硫酸钙复合抗生素制备的人工骨能够作为一种局部抗生素释放装置，被作为一种可生物降解的缓释系统负载抗生素实施给药[10-11]。动物实验和临床研究结果都表明硫酸钙具有良好的生物相容性[12-13]。

骨感染存有多种细菌并且耐药，对许多抗生素不敏感，万古霉素属于糖肽类抗生素，直接作用于细菌细胞壁前体羧基末端的D-丙酰胺-D-丙氨酸，抑制细胞壁蛋白的合成，能有效杀灭革兰阳性菌，对临床上较为棘手的甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌（MRSA）和表皮葡萄球菌感染性疾病有较好的疗效[14-15]，而且不易诱导细菌产生耐药性，和其他抗生素也不发生交叉耐药，属于快速杀菌剂，药力较强，常用来治疗开放性伤口和深部感染，尤其是MRSA导致的感染[14]。然而，万古霉素在骨组织的浓度只有血清中的15%～35%，为了在骨组织中达到最小抑菌浓度，关键是在血清中维持3～4倍的最小抑菌浓度。此外，在治疗骨髓炎治疗中通常需要连续给药4～6周，期间必须维持稳定的血药浓度，需要静脉连续给药，这必然会对体内其他器官产生毒副作用，文献报道万古霉素的肾毒性的发生率为 5%～7%，除了疾病本身和年龄因素以外就是用药时间[15-17]。将负载万古霉素的硫酸钙作为骨移植材料，置于感染性骨缺损处，不但可以直接释放高浓度的万古霉素，避免其副作用和耐药性，而且可填塞空腔，有利于成骨细胞及血管长入，降解后无需再次手术取出，非常适合作为治疗骨创伤感染的植骨材料[8,18-20]。蔡晓冰等[8]已尝试将负载万古霉素的硫酸钙材料用于治疗感染性骨缺损，临床结果表明该材料有利于成骨细胞和血管长入，促进骨折愈合。虽然硫酸钙作为抗生素载体在治疗感染性骨缺损方面有许多优势，但仍存在着抗生素突释、释放时间过短等缺陷。体外实验结果表明载万古霉素硫酸钙在24 h内即释放约90%的万古霉素，由于万古霉素是剂量和时间依赖性抗生素，必须在较长时间内维持一定的药物浓度才能达到抗菌效果[14]，如何在保持硫酸钙骨传导特性的同时，控制万古霉素的释放速度，在一定时间内维持足够高的局部药物浓度，成为目前载药硫酸钙人工骨材料所急需解决的一个难题。药物缓释系统可以使病灶部位在较长时间内维持足够高的药物浓度，有利于提高药效，减少药物使用剂量和给药次数，从而避免发生毒副作用。

有序介孔SiO2纳米颗粒 (MSNs)具有在2～50 nm范围内可连续调节的均一介孔孔径、规则的孔道、稳定的骨架结构、易于修饰的表面、较高的比表面积和无生理毒性的特点，非常适合用作药物分子的载体；同时，有序介孔SiO2材料具有很大的比表面积（＞ 0.9 m2/g）和比孔容（＞0.9 cm3/g），可以在材料的孔道里固定包埋各种药物，并可对药物起到缓释作用，提高药效的持久性。因此，近年来有序介孔 SiO2材料在药物缓释领域的应用得到日益的重视[21-22]。采用介孔 SiO2材料作为药物载体实现药物缓释的主要方法有两种。一种是通过调节介孔材料的孔径大小和形态来达到药物控制释放的目的，例如，Rehman F等[23]将SBA-15型介孔SiO2纳米微球的孔径从8.0nm缩小至6.0nm，最终其载止痛剂布洛芬的能力从18.0%提高到28.3%，并且有效延长了药物的释放时间，结果表明止痛剂布洛芬在模拟体液中的传输速度随着孔径的减小而减小；介孔 SiO2材料的外表面和孔道内表面带有活泼的硅羟基，可以进一步被有机基团改性[24]，例如巯基、氨基和羧基等活性基团。选用不同的改性官能团，可以调节官能团与药物之间的相互作用，从而进一步调节介孔 SiO2材料的载药量和控制药物释放的速度。

在体外洗提实验中，洗提液更换的频率和更换量是重要的实验影响因素，因为提洗液的更换难以完美地模仿局部微循环的规律，不能完全反应局部组织液的更替频率，故我们设计了各个时间点提洗液的全量更换和半量更换，从图1b可以看出，在全量更换浸提液组（S1、C1），药物最大浓度出现的时间一致，然而在后续的4d时间内，S1的药物浓度始终高于 C1。在半量更换浸提液组（S2、C2），均可以看到药物峰浓度延后，S2组更为明显。两者结果均证明了在添加了MSN的人工骨中，万古霉素有效浓度的释放时间较对照组有明显延长，这一结果和之前的研究相符[25]。而S2在浸提第96h，C2在浸提72 h分别再次出现药物释放小高峰，考虑可能因为经PBS浸泡后人工骨有断裂所致。以上结果已经可以说明负载万古霉素MSNs复合硫酸钙人工骨材料较单纯硫酸钙人工骨而言具有更好的延长万古霉素释放时间的作用。

万古霉素与 MSN结合后在释放是否仍然具有良好的抑菌性能，对此，我们设计了体外抑菌实验，选择了金黄色葡萄球菌标准菌株，检测该人工骨材料浸提液对其抑菌作用。从实验结果（见图2）可以看出，添加了MSN的实验组，在有效的释药时间内，其周围可以看到清晰的抑菌环，并且在相同时间点，其抑菌环直径大于对照组，不仅表明经过与MSN结合后，万古霉素依然保持了良好的抗菌活性，而且在第14天，S1组仍能看到清晰的抑菌环，其对照组C2的抑菌环不明显。再一次表明Van-MSNs-CaSO4具备缓释抑菌作用。

综上所述，既往已有的负载抗生素材料往往存在药物突释，无法较长时间维持药物释放，难以达到持续抑菌的效果。而万古霉素-介孔二氧化硅纳米颗粒-硫酸钙可以明显延长药物释放时间，理论上可以在局部形成较长时间的抑菌作用，Van-MSNs-CaSO4可以达到局部万古霉素缓慢释放的目的，在植入部位长时间地保持其有效抑菌浓度，发挥抗感染作用。