短链脂肪酸对C2C12小鼠骨骼肌细胞AMPK的作用研究

吕晓婷，洪宇桁，牛文彦

（1.天津医科大学免疫学系，天津300070；2.天津医科大学医学影像学院，天津300203）

糖尿病是因胰岛素绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低引起的代谢综合征，高血糖为其主要标志[1]。骨骼肌是机体摄取餐后葡萄糖的主要器官，摄取80%餐后升高的血糖，对维持血糖稳态发挥重要作用。运动时骨骼肌收缩，促进葡萄糖摄取，增加胰岛素敏感性，改善胰岛素抵抗，是预防和治疗2型糖尿病的有效方式[2]。单磷酸腺苷激活蛋白激酶（Adenosine 5′-monophosphateactivated protein kinase，AMPK）是由一个催化亚基（α）和两个调节亚基（β，γ）组成的异三聚体酶，是细胞能量感受器[3-5]。运动时肌肉收缩消耗能量，激活骨骼肌AMPK，进而调节能量代谢[4]。近年来，肠道菌群在肥胖、2型糖尿病和非酒精性脂肪肝等代谢疾病中的作用成为研究热点，已证实肠道菌群可通过调节机体的能量代谢影响2型糖尿病的发生发展[6]。有报道产丁酸菌对胰岛素抵抗具有改善作用，短链脂肪酸（short-chain fatty acids，SCFAs）是肠道产丁酸菌的代谢终产物，其中乙酸、丙酸和丁酸占95%，短链脂肪酸在维持肠道水电解质平衡、调节肠道的菌群平衡、改善肠道功能、抗肿瘤和调控基因等方面发挥重要作用[7]。生理情况下，短链脂肪酸经乙状结肠和直肠吸收，经下腔静脉到达全身循环，作用于外周组织。短链脂肪酸也有改善机体葡萄糖稳态和胰岛素敏感性的作用,有助于预防肥胖及相关代谢疾病的发生，但其对骨骼肌糖代谢的作用机制仍需探究[7]。已有文献支持乙酸钠（NaAce）、丙酸钠（NaPro）和丁酸钠（NaBut）作用于 C2C12小鼠骨骼肌细胞[8]，因此本研究分别应用乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠孵育C2C12小鼠骨骼肌细胞，探讨短链脂肪酸对C2C12小鼠骨骼肌细胞AMPK的作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料 小鼠骨骼肌细胞株C2C12（美国ATCC公司），DMEM培养基（美国GIBCO公司），MTS试剂盒（美国Promega公司），牛血清白蛋白（中国鼎国生物技术公司），抗磷酸化AMPK抗体（美国CST公司），抗β-actin抗体（中国Absin公司），偶联HRP的山羊抗兔抗体（美国JacksonImmuno Research公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 C2C12细胞用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM高糖培养基接种于板中，在37℃，5%CO2培养箱中培养。待细胞密度到80%时，用10%FBS DMEM高糖培基分别配置1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠，孵育C2C12细胞24 h。

1.2.2MTS实验 分别用0mmol/L，1mmol/L，2mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠孵育C2C12细胞24h，MTS法检测细胞生存率。

1.2.3 Western blot 配置RIPA裂解液（含蛋白酶抑制剂Na3VO41mmol/L，NaF0.5mmol/L，PIC1μmol/L和 PMSF 200 μmol/L）。弃去细胞上清液，用冷 1×PBS缓冲液洗两次，用细头吸管吸净，加入RIPA裂解液，置于冰上20 min，并收集。预冷离心机至4℃，13 000 r/min，离心 20 min，取上清。将 5×LSB 缓冲液与上清液按1：4的比例混匀，金属浴100℃煮10min。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白样品，转到PVDF膜上，用3%牛血清白蛋白封闭2 h，孵育一抗4℃过夜，二抗使用偶联辣根过氧化物酶HRP的山羊抗兔IgG孵育2 h，条带用ECL发光液孵育并用曝光机检测。β-actin为内参，Image J软件定量分析。

1.3 统计学处理 采用GraphPad Prism6统计软件进行统计学分析，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），实验数据均以mean±SEM表示，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠对C2C12细胞活力的影响 分别用不同浓度的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠孵育C2C12细胞24h。如图1所示，1mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L 的乙酸钠处理后细胞存活率分别为对照组的100.73%±0.07、98.76%±0.03、101.12%±0.05、107.15%±0.05 和103.11%±0.08倍，与对照组相比均无统计学差异，说明乙酸钠在浓度为1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8mmol/L和16mmol/L时对C2C12细胞没有细胞毒性；1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L的丙酸钠处理后细胞存活率分别为对照组的102.88%±0.03、1 04.13% ±0.02、102.71% ±0.06、99.55% ±0.02 和101.23%±0.02倍，与对照组相比均无统计学差异，说明丙酸钠在浓度为1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L时对C2C12细胞没有细胞毒性；1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L的丁酸钠处理后细胞存活率分别为对照组的104.05% ±0.05、102.18% ±0.02、101.91% ±0.05、106.60%±0.03和95.38%±0.03倍，与对照组相比均无统计学差异，说明丁酸钠在浓度为1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L时对 C2C12细胞没有细胞毒性，均可用于后续实验。

图1 不同浓度的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠对C2C12细胞生存率的影响Fig 1 Effects of different concentrations of sodium acetate,sodium propionateandsodiumbutyrateontheviabilityofC2C12cells

2.2 乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠对AMPK的影响 用不同浓度（0 mmol/L，1 mmol/L，2 mmol/L，4 mmol/L，8 mmol/L，16 mmol/L）的乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠分别孵育 C2C12细胞 24 h，Western blot检测 AMPK磷酸化和总蛋白。以横坐标为乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠的浓度，以纵坐标为pAMPK/β-actin的比值，如图2所示，与对照组相比，1 mmol/L和4 mmol/L乙酸钠孵育后，AMPK磷酸化水平分别是对照组的1.34±0.08倍（P<0.01） 和 1.30±0.08 倍（P<0.01），AMPK总蛋白没有变化；4 mmol/L丙酸钠孵育后，AMPK磷酸化水平是对照组的1.68±0.30倍（P<0.05），AMPK总蛋白没有变化；4 mmol/L，8 mmol/L和16 mmol/L丁酸钠孵育后，AMPK磷酸化水平分别是对照组的 1.52±0.11 倍（P<0.01）、1.34±0.10 倍（P<0.01）和 1.53±0.20倍（P<0.05），AMPK 总蛋白没有变化，提示乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠均激活AMPK且不影响AMPK总蛋白。

图2 C2C12细胞中AMPK pT172的磷酸化水平Fig 2 The phosphrylation of AMPK pT172 in C2C12 cells

3 讨论

AMPK是机体维持代谢平衡所需分子，其活化在糖脂代谢方面发挥重要作用[9]。AMPK在真核生物中普遍表达，其α亚基起催化作用，主要代表AMPK的活性，β和γ亚基在维持三聚体稳定性和作用底物特异性方面起重要作用，每个亚单位都存在 2~3 种基因所编码的异构体（α1，α2、β1，β2、γ1，γ2，γ3）[10]。α 亚单位中的 8 个位点（苏氨酸 172、苏氨酸258和丝氨酸485等）均可被磷酸化，其中苏氨酸172位点的磷酸化对AMPK活性起重要作用，该位点的磷酸化提示AMPK的活化。AMPK活性主要受细胞中AMP/ATP比值的调节，生理情况下，为了维持基本的代谢需要，细胞中维持着高浓度的ATP水平，运动时肌肉收缩，骨骼肌能量消耗增加可达100倍，ATP转化为 AMP，AMP/ATP比值升高，AMPK被激活，促进葡萄糖转运[4,11-12]。

肠道菌群寄居于人胃肠道内，它们能抵御感染和降低自体免疫疾病的患病风险，还能影响体重和消化能力[13]。将健康人的肠道微生物群转移到代谢综合征患者肠道内可提高代谢综合征患者的胰岛素敏感性[7]。丁酸菌等肠道微生物群发酵食物时由于缺乏合适的酶而不完全水解，产生短链脂肪酸，进入体循环直接影响外周组织的代谢和功能[14-15]。在肥胖小鼠中，补充丁酸盐可增加胰岛素敏感性并减轻体质量，可见短链脂肪酸在糖尿病等代谢疾病中发挥作用[16]。在肝细胞和脂肪细胞中，乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠通过激活AMPK防止高脂饮食诱导的肥胖[8]。本研究发现，在小鼠骨骼肌细胞中，乙酸钠、丙酸钠和丁酸钠均激活AMPK，提示短链脂肪酸可通过AMPK信号通路促进骨骼肌葡萄糖摄取。有文献报道，GPR41（G 蛋白偶联受体 41）和 GPR43（G 蛋白偶联受体43）是短链脂肪酸的受体，分布于骨骼肌和肝脏等器官中，短链脂肪酸可能通过GPR41/GPR43介导的机制增加骨骼肌葡萄糖摄取[7]。有研究指出，丁酸改善大鼠骨骼肌线粒体功能，促进PGC-1α（过氧化物酶体增殖物激活受体C辅助激活因子-1α）的表达，在能量代谢中发挥作用[17]，而增加PGC-1α的表达可激活小鼠骨骼肌AMPK，推测丁酸可能通过PGC-1α途径激活AMPK[17]。

综上所述，笔者发现短链脂肪酸磷酸化小鼠骨骼肌细胞AMPK，有助于进一步研究其改善胰岛素抵抗的详细机制，以及通过调节肠道菌群改善胰岛素抵抗。