异丙酚通过诱导幼鼠海马神经元线粒体自噬减轻其肝缺血再灌注后脑损伤

吕景淑，贾莉莉，喻文立

（1.天津医科大学一中心临床学院麻醉科，天津300192；2.天津市第一中心医院麻醉科，天津300192）

肝移植是终末期肝病患儿的唯一治疗手段。随着手术技术和术后管理的进步，儿童肝移植患者术后5年生存率高达80%以上[1]。2012年以后，每年婴幼儿患者为主的胆道闭锁在我国儿童肝移植中的占比达到75%以上[2]。然而，大多数患儿都会发生术后神经系统并发症[3]，发生率在9%～48%之间，且明显高于成人。肝缺血再灌注是肝移植术中必不可少的步骤，研究证明，该过程可造成多个远隔脏器如：心、肺、肾、脑、肠等的损伤[4]。异丙酚是临床上常用的麻醉药，大量实验证明，它可通过抑制小胶质细胞活化[5]，抑制内质网应激介导的凋亡[6-7]，减轻炎症反应[8]等多种途径发挥脑保护作用。线粒体自噬是选择性自噬的一种，对于维持细胞内和组织内的稳态具有重要的作用。关于异丙酚对肝缺血再灌注后幼鼠海马神经元线粒体自噬的影响研究甚少，本研究就此进行探讨。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组 2周龄C57BL/6雄雌不分的小鼠，体质量约6～8 g（华阜康生物科技股份有限公司提供），饲养在干净、恒温恒湿的环境中，自由摄取食物和水。随机分为4组：假手术组(S组)，肝缺血再灌注组（IR组），异丙酚组（P组），异丙酚+自噬抑制剂3-MA组（3-MA组）。

1.2 动物模型的构建 参照文献[9]建立小鼠70%肝热缺血再灌注模型。术前采用50 μg/g的戊巴比妥腹腔内注射麻醉，麻醉后将小鼠固定在手术台上，沿腹白线纵行切口入腹，暴露手术视野，应用棉签将肝门附近肠管等脏器轻轻推至左髂区，游离第一肝门。用血管夹夹闭肝左、中叶脉管（门脉、动脉与胆道）的共干，此时缺血肝叶变白，淤血肝叶颜色加深，70%的肝脏热缺血模型造模成功。将腹腔内脏器归位，临时合拢腹腔，用无菌纱布遮盖腹壁切口，缺血1 h后松开血管夹，随后关腹缝合切口。S组仅开腹、游离第一肝门以及1 h后关腹等操作，无血管夹闭，P造模前30 min腹腔注射异丙酚（20 mg/kg,阿斯利康，美国），3-MA组造模前30 min腹腔注射异丙酚 20mg/kg和5μL溶于PBS的3MA（100 nmol/μL），S和IR组在开腹前30 min腹腔内注射等量乳化剂。该模型动物死亡率约为10%，4只老鼠多死于造模初期，死亡原因主要包括麻醉意外致死（2只），手术过程粗暴导致流血过多（1只），血管夹闭过深（1只），每死亡1只即刻重新造模补齐该组的数目。

1.3 标本采集与制作 再灌注后6 h，各组小鼠摘眼球取血标本，3 500 r/min离心15 min，取血清，保存于-80℃以待检测ELISA。剥离完整脑组织，一份用多聚甲醛固定保存，以备后期的石蜡切片。快速分离脑组织中的海马组织，用刀片切取海马CA1区1 mm×1 mm×1 mm组织块保存在2.5%戊二醛固定液置于4℃冰箱，以备观察透射电镜。将海马组织保存于-80℃冰箱，用于后期检测Westernblot。

1.4 ELISA法测脑损伤标志物及炎症因子 参照南京建成生物有限公司的试剂盒说明书，采用双抗体夹心法，经包被、加样、加酶标抗体、加底物显色、终止反应等步骤，最后计算出各组NSE、S100β、IL-6、TNF-α的浓度。

1.5 透射电镜法观察自噬小体和线粒体形态 取出2.5%戊二醛固定液固定后的海马组织标本，PBS冲洗3次，1%四氧化锇固定液固定1 h，PBS清洗3次，在丙酮和双蒸水按比例配制50%、70%、80%、90%、100%（V/V）的浓度梯度进行脱水，进行包埋渗透，制成超薄切片60 nm，用1%醋酸铀-枸橼酸铅双染色，在透射电子显微镜下观察每个标本海马神经元内自噬小体和线粒体的形态结构。

1.6 Western blot法测 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3 蛋白的表达情况 取冰冻海马组织，进行称重，研磨，以质量：体积=1∶10的比例加入蛋白裂解液、蛋白酶抑制剂及磷酸化酶抑制剂。脑组织匀浆放冰上裂解，每隔10 min震荡1次，30 min后，4℃13 000 r/min离心20 min，取上清，BCA法进行蛋白定量。配制12%聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，蛋白上样量为50 μg，随后转印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），室温下5%脱脂牛奶封闭1h，TBST洗3次，每次10min，随后加入 1：1 000 一抗 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3（均购于美国CST公司），置于4℃冰箱孵育过夜。TBST清洗3次，每次10 min；加入1：2 000 HRP标记山羊抗兔IgG二抗（购于北京中杉金桥公司），于室温下摇床孵育1h，TBST清洗3次，每次10 min；加入显色液避光显影曝光，系统照相记录实验结果。采用ImageJ图像分析软件测定蛋白条带的灰度值，以LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3 分别与内参 β-actin（1∶1 000，购于美国CST公司）灰度值的比值反应目的蛋白的表达水平。

1.7 统计学处理 用SPSS 19.0进行统计学分析处理。正态分布计量资料以±s表示，组间比较采用单因素方差分析。GraphPadPrism 6制造图表分析，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组脑损伤标志物及炎症因子的表达水平 与S 组相比，IR 组、P 组、3-MA 组 NSE、S100β、IL-6、TNF-α均有所增加，且差异具有统计学意义（P＜0.05），与IR组相比，P组的各项指标下降，3-MA组各项指标上升，且差异具有统计学意义（P＜0.05）（表 1）。

表 1 血清 NSE、S100β、IL-6、TNF-α 浓度的比较（n=10，±s）Tab 1 concentrations of NSE,S100β,IL-6 and TNF-α（n=10，±s）

表 1 血清 NSE、S100β、IL-6、TNF-α 浓度的比较（n=10，±s）Tab 1 concentrations of NSE,S100β,IL-6 and TNF-α（n=10，±s）

与 S组比较，aP＜0.05；与 IR 组比较，bP＜0.05

组别NSE/（ng/mL）S100β/（mg/mL）IL-6/（pg/mL）TNF-α/（pg/mL）S 组 14.21±0.76 1.34±0.06 36.7±2.9 42.5±4.3 IR 组 30.14±1.71a 2.06±0.13a 119.7±6.2a 105.7±6.1a P 组 23.94±2.14ab 1.73±0.08ab 78.2±3.1ab 70.5±5.9ab 3-MA 组 38.66±0.87ab 2.38±0.07ab 131.7±5.2ab 113.7±8.6ab

2.2 各组自噬体及线粒体结构 透射电镜可观察到自噬小体和线粒体超微结构，两组结果综合提示：与S组相比，IR组、P组、3-MA组线粒体数量均有所下降，且线粒体形态结构紊乱，线粒体肿胀增加，自噬小体增多;与IR组相比，P组线粒体数量增多，线粒体结构较完整，自噬小体数量增多，3-MA组，线粒体数量和质量均下降，且自噬小体数量减少（图 1）。

图1 各组电镜结果的比较（×5 000）Fig 1 Results of TEM in each group(×5 000)

2.3 各组LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白的表达情况与 S组相比，IR 组、P组、3-MA 组的 LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白表达水平上升，且差异具有统计学意义（P<0.05），与 IR 组相比，P组的 LC3Ⅱ、Nix蛋白表达水平上升，但Caspase-3蛋白表达水平下降，3-MA组的 LC3Ⅱ、Nix蛋白表达水平下降，但Caspase-3蛋白表达水平上升，差异均具有统计学意义（P<0.05）（图 2）。

图2 各组LC3Ⅱ、Nix、Caspase-3蛋白的表达情况Fig 2 expressionsofLC3Ⅱ,NixandCaspase-3proteinsineachgroup

3 讨论

3.1 线粒体自噬在肝缺血再灌注之脑损伤中的作用 自噬是细胞通过溶酶体降解蛋白和受损细胞器的过程，选择性清除线粒体即为线粒体自噬。线粒体自噬是细胞实现线粒体质量控制的主要途径，对维持细胞稳态至关重要。Nix是定位于线粒体外膜的类BNIP3蛋白，参与了线粒体自噬的Parkin非依赖途径。有文献报道，其氨基酸序列中含有WXXL基序。Nix能通过该基序与 LC3及LC3同源物CABA受体相关蛋白结合，诱导线粒体自噬发生从而降解清除多余的线粒体。Zhang等证明了在低氧的情况下，可以通过BNIP3依赖的方式诱导激活线粒体自噬[10]。Wu等研究发现在缺氧状态下，Nix可激活线粒体自噬[11]。有研究表明，Sirt1可通过恢复线粒体自噬水平减轻肝缺血再灌注损伤[12-13]。然而，SONG等实验研究显示FOXO3a可通过抑制肝细胞线粒体自噬和抑制细胞凋亡减轻小鼠肝缺血再灌注损伤[14]。

在本实验中，相对于S组，IR组的透射电镜结果显示自噬小体数量增加，且线粒体肿胀明显，线粒体自噬相关蛋白Nix、LC3Ⅱ表达量增高，凋亡蛋白Caspase-3表达量增多，脑损伤标志物NSE、S100β和炎症因子IL-6、TNF-α水平也明显增加，然而加入自噬抑制剂3-MA后，线粒体自噬水平明显降低，但电镜结果显示损伤的线粒体数量反而增加，凋亡蛋白Caspase-3及脑损伤标志物NSE、S100β和炎症因子IL-6、TNF-α水平进一步增加。以上结果说明，肝缺血再灌注后，线粒体自噬可能起到保护作用，通过及时清除受损的线粒体，以抑制其释放氧化自由基，从而控制氧化应激损伤，抑制该过程则会引起炎症反应加剧，凋亡增加。

3.2 异丙酚对肝缺血再灌注后小鼠海马神经元线粒体自噬的影响 异丙酚是临床常用的静脉麻醉药，现已有多项研究证明异丙酚可对自噬产生影响。Kim 等[15]、Chang 等[16]、Li等[17]、Yoon 等[18-19]均证实了异丙酚诱导自噬的产生，减轻氧化应激损伤。然而，Cui等[20]、Li等[21]、Chen 等[22]、Yang 等[23]研究却发现异丙酚可抑制自噬从而发挥保护或加重损伤的作用。

本实验研究中，与IR组相比，P组，透射电镜结果显示自噬小体数量增加，且线粒体结构破坏减少，线粒体自噬相关蛋白Nix、LC3Ⅱ表达量增高，而凋亡蛋白Caspase-3表达量却下降，脑损伤标志物NSE、S100β和炎症因子IL-6、TNF-α水平也明显降低，该实验结果说明，线粒体自噬本身在肝缺血再灌注后起一定的保护作用，然而，IR组自噬流或许受到了一定的抑制，异丙酚可恢复肝缺血再灌注线粒体自噬流的抑制作用，或者，异丙酚可进一步激活线粒体自噬，从而起到保护作用。

3.3 本实验的不足及临床应用建议 本实验研究仅仅从脑损伤标志物和凋亡蛋白水平研究其对大脑的影响，显然不足以对其脑保护作用下结论，并且本实验为短期实验，未研究其长期的影响结果。本实验样本数量偏小，结论需大量动物实验和临床实验加以证实。关于异丙酚诱导线粒体自噬的机制及其上下游的影响因素未进行探讨。今后应继续探索其具体信号通路，积极寻找在肝缺血再灌注中的脑保护措施。