竹柏种仁油脂成分及其抗氧化活性分析

徐 华 杨德孟 楼乔明 张进杰 杨文鸽 徐大伦

(宁波大学海洋学院，宁波 315211)

竹柏(Podocarpusnagi)，又名罗汉柴、山杉、铁甲树、椰树等，为罗汉松科(Podocarpaceae)竹柏属(Nageia)的一种常绿裸子植物，广泛分布于我国浙江、福建和广东等长江以南地区。竹柏是我国重要的药原植物，其有着悠久的药用历史，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤及抗病毒等药理作用[1-2]。竹柏种子种粒大，单株产量高，且富含油脂，是优良的油料能源树种，具有很高油脂开发潜力。

目前，国内外对竹柏的研究主要集中在育苗种植和药理作用等方面，而对其种仁油脂提取、油脂成分和抗氧化活性等方面的研究鲜见报道。因此，本研究以竹柏种仁为原料，采用5种方法对其油脂进行提取，并通过核磁共振(NMR)和气相色谱-质谱(GC-MS)技术分别对竹柏种仁油脂成分和脂肪酸组成进行分析，同时结合DPPH自由基清除法和羟基自由基清除法对其油脂的抗氧化活性进行研究，以期为竹柏资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

竹柏(Podocarpusnagi)种籽；氘代氯仿(CDCl3，氘代度99.8%+0.03%TMS)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)；三氯甲烷、甲醇、正己烷、乙醇、甲基叔丁基醚和硫酸钠等分析纯。

1.2 仪器与设备

7890A型气相色谱仪；M7-80EI型质谱仪；AVANCE Ⅲ 400 MHz超导核磁共振谱仪；SpectraMax i3型多功能酶标仪；RV-10型旋转蒸发仪。

1.3 试验方法

1.3.1 种籽预处理

将竹柏种籽于50 ℃干燥至恒重，去壳后粉碎，并经40目过筛备用。

1.3.2 油脂提取

Folch法[3]：取2 g样品， 加入40 mL三氯甲烷-甲醇混合液(2∶1)超声30 min；过滤后，加入8 mL 0.9%氯化钠溶液，振荡后经静置分层，取三氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，于105 ℃干燥至恒重。

Bligh-Dyer法[4]：取2 g样品，依次加入20 mL甲醇、10 mL三氯甲烷和8 mL蒸馏水，混合液超声30 min，再依次加入10 mL三氯甲烷和10 mL蒸馏水；过滤后，经静置分层，取三氯甲烷层，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后，于105 ℃干燥至恒重。

甲基叔丁基醚法[5]：取2 g样品，依次加入9 mL甲醇和30 mL甲基叔丁基醚，混合超声30 min，再加入37.5 mL蒸馏水，经静置分层，收集甲基叔丁基醚层，减压浓缩后，于105 ℃干燥至恒重。

正己烷-异丙醇法[6]：称取2 g样品，加入40 mL正己烷-异丙醇混合液(3∶2)，混合超声30 min，经抽滤除杂，加入16 mL 10 g/L Na2SO4溶液，经静置分层，收集正己烷层，减压浓缩后，于105 ℃干燥至恒重。

索氏提取法[7]：取2 g样品，装入滤纸筒中，取50 mL石油醚(30～60 ℃)，于80 ℃提取3 h，收集石油醚，减压浓缩后，于105 ℃干燥至恒重。

1.3.3 核磁共振分析

取50 mg样品，加入0.6 mL氘代氯仿溶解，转移至核磁管中用于核磁共振分析。氢谱参数：脉冲序列zg30，检测温度为293.4 K，90°脉冲宽度P1为10.00 s，谱宽SWH为8 012.82 Hz，脉冲延迟时间D1为1 s，采样点数TD为6 5536，扫描次数NS为16，空扫DS为2；碳谱参数：脉冲序列zgpg30，检测温度294.1 K，90°脉冲宽度P1为9.50 s，谱宽SWH为24 038.46 Hz，脉冲延迟时间D1为2 s，采样点数TD为6 5536，扫描次数NS为50，空扫DS为4。氢谱和碳谱的化学位移均以四甲基硅烷(TMS)为标准校正，并利用MestReNova软件对图谱进行分析。

1.3.4 甲酯化衍生

取50 mg竹柏种仁油脂，加入2 mL不同浓度的KOH-甲醇溶液(0、0.5、1.0、1.5、2.0 mol/L)，室温反应3 min；依次加入1 mL饱和氯化钠溶液和1 mL正己烷，振荡后5 000 r/min离心2 min，取正己烷层，用于1H-NMR和GC-MS分析。

1.3.5 脂肪酸组成分析

色谱条件：DB-WAX 毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)，进样口温度250 ℃，检测器温度250 ℃；升温程序：初始温度150 ℃，保持3.5 min，以20℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；进样量1.0 μL，分流比50∶1；以氦气为载气，载气流量1 mL/min，溶剂延迟时间：3 min。

质谱条件：GC-MS接口温度250 ℃，EI离子源，离子源温度200 ℃，电离能量70 eV，质量扫描范围：m/z 50～650 u。

1.3.6 抗氧化活性测定

DPPH自由基和羟基自由基清除率实验参照文献[8-9]方法进行。

1.4 数据处理

除核磁共振和气相色谱-质谱外，其他指标均平行测定3次，并利用 SPSS18.0 软件对数据进行统计分析，结果以平均值±标准差(mean±SD)表示；同时采用单因素方差分析法(ANOVA，Tukey 检验)进行显著性检验，并采用 Duncan’s 法进行单因子多重比较分析，P<0.05 为差异显著。

2 结果与分析

2.1 竹柏种仁油脂提取

通过5种方法对竹柏种仁的油脂进行提取，油脂提取结果列于表1。从表1可知，不同方法对竹柏种仁油脂提取率具有显著差异(P<0.05)，其中 Folch法的提取率最高(53.81%)，Bligh-Dyer法(52.00%)、甲基叔丁基醚法(50.74%)和正己烷-异丙醇法(49.93%)次之，而索氏提取法(46.83%)最低。综合比较5种方法发现有机溶剂的极性和溶解性是影响竹柏种仁油脂提取率的重要因素。有机溶剂提取法主要基于相似相溶原理，Folch法、Bligh-Dyer法、甲基叔丁基醚法和正己烷-异丙醇法均为双溶剂提取体系，其中极性溶剂与竹柏种仁细胞膜的极性脂结合，进而破坏脂质与蛋白质分子间的氢键和静电作用，使非极性溶剂进入细胞并溶解胞内疏水的油脂成分，从而提高油脂提取率，因此上述4种方法的油脂提取率显著高于索氏提取法(P<0.05)[10-11]。同时，三氯甲烷对油脂的溶解性优于甲基叔丁基醚和正己烷，这也导致Folch法和Bligh-Dyer法的提取率高于甲基叔丁基醚法和正己烷-异丙醇法。综合考虑油脂提取率，Folch法对竹柏种仁油脂的提取效果最好，是理想的提取方法。因此采用Folch法对竹柏种仁油脂进行提取，并用于后续的油脂成分和抗氧化活性分析。

表1 不同方法的竹柏种仁油脂提取率

图1 竹柏种仁油脂的核磁共振碳谱图

2.2 油脂成分分析

竹柏种仁油脂的核磁共振碳谱(13C-NMR)见图1，并根据13C-NMR谱中化学位移和信号模式，参考文献[12-13]对信号峰进行归属。化学位移δ=176.82处谱峰归属为游离脂肪酸羰基中的碳原子；δ=173.17～173.03和δ=172.77处谱峰分别归属为甘油骨架sn-1,3位和sn-2位的脂肪酸羰基碳原子；δ=131.00～129.64归属为单不饱和脂肪酸的烯烃碳原子，而δ=128.30～127.86归属为亚油酸的烯烃碳原子；δ=70.82 归属为甘油磷脂中sn-2位上的碳原子；δ=68.86 和δ=62.07 分别归属为甘油三酯sn-2位和sn-1,3位上的碳原子；δ=54.35归属为磷脂酰胆碱(PC)中与氮原子相连的甲基碳原子((CH3)3N-)；δ=34.16～34.00和δ=33.40处谱峰分别归属为与sn-2位和sn-1,3位羰基直接相连的亚甲基上的碳原子；δ=14.13～14.09处谱峰归属为脂肪酸末端甲基上的碳原子，甾醇C18(-CH3)特征峰信号在δ=11.55处。

根据13C-NMR共振峰面积进行定量分析可知：竹柏种仁油脂中甘油磷脂(GPL)与甘油三酯(TAG)的摩尔比为0.03，游离脂肪酸与总脂肪酸的摩尔比为0.02，而甾醇与总脂肪酸的摩尔比不足0.01，表明竹柏种仁油脂的主要成分为甘油三酯，而磷脂、游离脂肪酸和甾醇等成分含量极低。

2.3 脂肪酸组成分析

2.3.1 甲酯化衍生

竹柏种仁油脂及其脂肪酸甲酯的核磁共振氢谱(1H-NMR)见图2。根据1H-NMR谱中化学位移和信号模式可知，δ=5.30～5.25谱峰为甘油骨架中次甲基氢质子，δ=4.32～4.28和δ=4.17～4.13谱峰为甘油骨架上的亚甲基氢质子；而δ=3.70谱峰为脂肪酸甲酯中甲氧基氢质子，δ=2.34～2.29谱峰为脂肪酸羰基端2位亚甲基氢质子，因此可通过甲氧基氢质子与脂肪酸羰基端2位亚甲基氢质子的信号峰面积比来计算衍生过程中的甲酯转化率[14-16]。竹柏种仁油脂在室温条件下，经不同浓度KOH-甲醇溶液衍生3 min，其甲酯转化率列于表2。由表2可知，当KOH浓度为0.5 mol/L时，甲酯转化率仅为43.86%；随着KOH浓度增加，甲酯转化率逐渐增加；当KOH浓度为2 mol/L时，甲酯转化率达到99.80%，表明此时竹柏种仁油脂几乎完全转化为脂肪酸甲酯。

图2 竹柏种仁油脂(A)和脂肪酸甲酯(B)的核磁共振氢谱图

表2 竹柏种仁油脂的甲酯转化率

2.3.2 脂肪酸分析

竹柏种仁油脂经2 mol/L KOH-甲醇溶液室温甲酯化衍生3 min后，采用气相色谱-质谱技术对其脂肪酸组成进行分析，脂肪酸总离子流色谱图见图3，鉴定结果列于表3。

图3 竹柏种仁油脂的脂肪酸总离子流色谱图

表3 竹柏种仁油脂的脂肪酸组成

从竹柏种仁油脂中共鉴定出7种脂肪酸，主要为棕榈酸(C16∶0)、油酸(C18∶1n-9)、亚油酸(C18∶2n-6)和花生烯酸(C20:1n-9)。竹柏种仁油脂的脂肪酸组成以不饱和脂肪酸为主，含量高达93.13%，且其中以亚油酸(43.49%)含量最高，花生烯酸(30.65%)和油酸(18.65%)含量次之；而饱和脂肪酸含量较低，仅为6.87%。

油酸和花生烯酸作为人体重要的单不饱和脂肪酸，能有效调节血脂，降低血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量，预防高血脂和动脉粥样硬化等心血管疾病，同时亦能有效减少机体内的氧化应激产物，降低机体的过度性炎症反应，有助于机体康复[17-18]。亚油酸是人体必需的n-6型多不饱和脂肪酸，参与调节人体生理代谢，可有效预防高血脂和高胆固醇血症，并具有抗癌、降血压和预防动脉硬化等功效[19-20]。竹柏种仁油脂中富含油酸、亚油酸和花生烯酸等不饱和脂肪酸，表明其具有很高的营养价值和保健功效，可作为特种植物油料进行开发利用，具有良好的应用前景和经济价值。

2.4 抗氧化活性

竹柏种仁油脂对DPPH自由基清除率和羟基自由基清除率分别见图4和图5。由图4可知，竹柏种仁油脂对DPPH自由基具有一定的清除能力，且清除率随浓度增加而逐渐升高，并呈现出一定的剂量效应；当油脂浓度为6 mg/mL时，清除率达到74.73%。通过清除率拟合曲线，可得竹柏种仁油脂清除DPPH自由基的IC50为3.36 mg/mL。由图5可知，竹柏种仁油脂能有效清除羟基自由基，且清除率随浓度增加而显著提升；当油脂浓度为0.6 mg/mL时，清除率达到75.05%。通过清除率拟合曲线，可得竹柏种仁油脂清除羟基自由基的IC50为0.38 mg/mL。DPPH自由基是一种稳定的自由基，其广泛用于评估油脂的自由基清除活性[21]；羟基自由基是活性氧中最活泼的自由基之一，其易与生物分子反应，引起组织损伤或细胞死亡[22]。竹柏种仁油脂能有效清除DPPH自由基和羟基自由基，表明其具有较好的抗氧化能力，可用于功能性油脂产品的开发。

图4 竹柏种仁油脂的DPPH自由基清除率

图5 竹柏种仁油脂的羟基自由基清除率

3 结论

3.1 5种方法对竹柏种仁油脂的提取率具有显著差异(P<0.05)。Folch法的油脂提取率最高(53.81%)，显著高于Bligh-Dyer法、甲基叔丁基醚法和正己烷-异丙醇法等4种提取方法，是竹柏种仁油脂提取的理想方法。

3.2 竹柏种仁油脂以甘油三酯为主，磷脂、游离脂肪酸和甾醇含量极低。竹柏种仁油脂经2 mol/L KOH-甲醇溶液室温衍生3 min，甲酯转化率达到99.80%；同时竹柏种仁油脂脂肪酸以油酸(C18∶1n-9，18.65%)、亚油酸(C18∶2n-6，43.49%)和花生烯酸(C20∶1n-9，30.65%)为主，具有很高的营养价值和保健功效。

3.3 竹柏种仁油脂对DPPH自由基和羟基自由基具有较好的清除能力，且两者的IC50分别为3.36 mg/mL和0.38 mg/mL，表明竹柏种仁油脂具有较好的抗氧化能力，可作为特种植物油料进行开发利用，具有良好的开发和应用前景。