利用微滴式数字PCR技术检测大豆毛油中的转基因成分

柴成梁 唐柏飞 常晓娇 林振泉 孙长坡

(国家粮食和物资储备局科学研究院粮油加工研究所1，北京 100037)(中国粮食研究培训中心2，北京 100031)

转基因大豆是利用现代生物技术，将外源基因导入并整合到大豆基因组中，通过外源基因的稳定遗传和表达，实现大豆的品质创新和性状改良[1]，是世界上商品化最早、推广应用速度最快、种植面积最广的转基因粮食作物[2]。我国是转基因大豆的进口大国，且呈逐年增加的趋势，2017年我国进口9 553万t大豆，其中主要为转基因大豆[3]。由转基因大豆加工而成的大豆油、色拉油成为进入消费者生活的食用油。判定食用的大豆油是否含有转基因成分，以及含有哪种外源转基因成分，是国家监管部门、大豆加工企业和公众密切关心、关注的问题。然而，大豆油在制备精炼过程中破坏了大豆的DNA[4-5]，造成检验时DNA富集难度增加，严重影响了大豆油转基因检测的准确度。到目前为止，国家已经颁布的标准中没有涉及转基因大豆油的检测标准，而对转基因大豆的检测标准无法应用于大豆油的转基因成分检测[6]。

数字PCR(digital PCR，dPCR)技术是近些年来兴起的一项针对单分子目标DNA的定量分析技术，其原理是将待测样品分成几十到几万份，相应分配到不同的反应单元中，每个反应单元中不含有或含有一个至多个拷贝的目标DNA分子，在每个反应单元中分别对目标DNA分子进行PCR扩增，扩增结束后采用泊松概率分布公式等统计学公式分析单个反应单元的阳性信号，来定量DNA拷贝数[7]。数字PCR技术摆脱了对标准曲线的依赖，具有更高灵敏度和准确度。数字PCR技术可以分为两类:微滴式数字PCR(droplet dPCR，ddPCR)和芯片式数字PCR(chip dPCR，cdPCR)[8]。数字PCR作为更精确和更灵敏的DNA检测新技术，为转基因成分的分析提供了新的手段，近年来国内外研究者不断探索利用数字PCR技术对转基因成分进行分析。Corbisier等[9]利用数字PCR分析了玉米种子中外源基因和内标准基因的拷贝数之比，该结果荧光定量PCR技术检测的结果相同，证明了数字PCR技术应用于转基因成分检测的可行性。Dany等[10]应用微滴数字PCR技术对食品和饲料中的转基因成分进行了精确定量分析。隋志伟等[11]应用数字PCR技术成功研制了转基因水稻TT51-1标准物质。潘广等[12]基于微滴式数字PCR平台在国内首次建立了转基因玉米品系T25的单/双重微滴式数字PCR定量方法。

数字PCR技术作为高灵敏度、高精确度的DNA检测技术，在植物的转基因成分检测方面已有了一定的应用[13-17]，但鲜见其应用于植物油中的转基因成分检测。本研究利用微滴式数字PCR技术对3份大豆毛油样品进行转基因成分检测，确定其中1份大豆毛油含有外源转基因成分，另外2份为非转基因大豆油。同时，运用常规PCR方法和荧光定量PCR方法对提取的大豆毛油DNA样品进行外源目标基因的扩增，未检测到转基因成分，说明高灵敏度的数字PCR技术更适用于植物油样品的转基因成分检测。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料

本实验检测的大豆毛油样品及非转基因大豆油样品均由北京某粮油公司提供，大豆毛油样品是该公司运用浸出法提取获得；PCR反应所需的引物和TaqMan探针均由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成，TaqMan探针所用的荧光基团和淬灭基团分别为FAM和BHQ1，实验所用引物和探针序列列于表1中。

1.1.2 试剂与仪器

数字PCR反应液、常规PCR反应液：TAKARA公司；DNA marker：Genstar公司；琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒：中科瑞泰公司； DNA荧光染料Goldview：北京鼎国昌盛生物技术公司；TE缓冲液由本实验室配制保存:0.01 mol/L Tris-HCl(pH8.0) + 0.001 mol/L EDTA(pH 8.0)。

Bio-rad电泳槽、恒压/恒流电泳仪、凝胶成像系统；PCR热循环扩增仪；QX 200微滴式数字PCR系统。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆毛油样品DNA提取

取4个50 mL离心管，每管取20 mL毛油样品和20 mL正己烷，常温下置于磁力搅拌器上混匀搅拌30 min，即为油相；取混匀好的油相20 mL和TE缓冲液20 mL，振荡摇床混匀1 h；8 000 r/min、4 ℃离心5 min，取下层水相到新的4个50 mL离心管中；向水相中加入等体积的混匀好的油相，振荡摇床混匀1 h；重复上述8 000 r/min离心加入等体积混匀好的油相，振荡装匀1 h，至毛油使用量为100 mL；最后一次取水相到新的4个离心管后，再离心8 000 r/min、4 ℃离心5 min，小心取水相到新的4个离心管中，加30 μL 助沉剂，1倍体积的预冷的异丙醇，-20 ℃放置过夜；15 000 r/min、4 ℃离心30 min，倒掉液体，用100 μL TE缓冲液反复冲洗有沉淀的部位，收集并移到1.5 mL离心管中，加1倍体积的酚：氯仿：异戊醇(25∶24∶1)溶液，混匀，12 000 r/min、4 ℃离心10 min，取水相到新离心管中；加10 μL carrier RNA和1倍体积的预冷的异丙醇，-20 ℃放置过夜；14 000r/min、4 ℃离心30 min，弃上清；向沉淀中加入800 μL 70%乙醇，混匀，14 000 r/min、4 ℃离心30 min；弃上清，室温晾干沉淀15～20 min，加50 μL TE缓冲液，即为从大豆毛油提取的DNA溶液。

大豆毛油样品DNA提取结束后，立即进行数字PCR检测，以防DNA降解。

1.2.2 微滴式数字PCR检测大豆毛油样品DNA的转基因成分

1.2.2.1 微滴式数字PCR扩增方法

提取的大豆毛油样品DNA转基因成分数字PCR扩增实验设阳性对照、阴性对照和空白对照作为质量控制。阳性对照为含有待测序列的质粒，阴性对照为非转基因大豆毛油，空白对照是以水代替DNA模板。每个样品数字PCR反应设置2个平行。

表1 引物和探针列表

扩增体系和程序：配制探针法微滴式数字PCR反应体系20 μL，引物终浓度为900 nmol/L，探针终浓度为250 nmol/L，振荡混匀，离心除气泡，加入Bio-Rad公司的微滴生成卡中，通过形成油包水结构实现体系的分割。将生成的微滴全部转入荧光PCR反应板中，进行PCR扩增，反应程序为：1)95 ℃，10 min(预变性)；2)94 ℃，30 s； 60 ℃，60 s；40循环(变性，复性)；3)98 ℃，10 min(终止反应，并使微滴结构更稳定)；4)4 ℃，Hold(结束)。

反应结束后用微滴分析仪对扩增产物进行计数分析。

1.2.2.2 微滴式数字PCR检测结果判定

空白对照样品无扩增信号，阴性对照样品只有大豆内源基因扩增，各目标基因阳性对照均有扩增，表明数字PCR体系正常工作。在数字PCR体系正常工作条件下，根据目标基因有无扩征信号判断检测的大豆毛油样品是否含有转基因成分。

1.2.3 常规PCR检测大豆毛油样品DNA的转基因成分

以提取获得的毛油DNA样品为模板，并设置好阴性对照和空白对照，进行常规PCR反应，以对比两种方法检测大豆毛油转基因成分的优劣。

20 μL的常规PCR反应体系包括模板2 μL，正向引物及反向引物各0.3 μL，2×PCR Mix 10 μL和7.4 μL超纯水。反应程序为：(1)95 ℃变性5 min；(2)94 ℃变性30 s；(3)54 ℃退火30 s；(4)72 ℃延伸(延伸时间根据目的基因片断长度计算)；(5)步骤(2)到步骤(4)进行30个循环；(6)72 ℃延伸10 min；(7)20 ℃ 10 min。

反应结束后用琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。

2 结果与分析

2.1 大豆毛油样品DNA提取

各取每个大豆毛油样品100 mL，按本实验所设计的DNA提取方法对大豆毛油样品进行DNA提取，并进行琼脂糖凝胶电泳分析，结果如图1所示。

注：A～C分别为提取的A、B、C 3个毛油样品的基因组；Marker从上至下依次为：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

2.2 微滴式数字PCR检测大豆毛油样品DNA

大豆毛油样品DNA提取结束后，为防止DNA降解对检测结果的影响，立即对所获得的DNA进行数字PCR反应，结果如图2所示。

数字PCR反应结束后，通过Bio-rad QX 200软件分析直接读出检测结果。

如图2所示，此结果为阳性对照和空白对照样品检测大豆内源基因Lectin的检测结果。蓝斑表示检测到荧光信号，黑斑表示无荧光信号。A02、B02、C02这3个孔分别是A、B、C样品的空白对照，D02是阳性对照。由图2的结果可知，只有阳性对照样品能检测到Lectin基因。

由图3可见，A、B、C 3个毛油样品和阴性对照样品均能检测出大豆内源基因Lectin。由图4可知，阴性对照样品未能检测出外源基因成分。结合图2～图4可知，A、B、C 3个大豆毛油样品基因组DNA提取成功，且数字PCR体系工作正常，在此情况下，得到的外源转基因成分检测结果真实可靠。

图2 对照样品大豆内源基因Lectin检测结果

图3 A、B、C 3个毛油样品和阴性对照样品大豆内源基因Lectin检测结果

图4 阴性对照样品外源基因CaMV35S、NOS和EPSPS检测结果

图5 A、B、C 3个毛油样品外源基因检测结果

由图5可知，A样品能检测出外源基因CaMV35S和Pat，未检测出外源基因NOS 、EPSPS和CryIA(c)，说明A毛油样品是由混有除草剂大豆A5547-127的大豆原料加工而成，而B、C毛油样品未检测出外源基因，说明B、C为非转基因大豆油。

2.3 常规PCR检测大豆毛油样品DNA

作为对比，用常规PCR方法和荧光定量PCR方法检测所提取的大豆毛油DNA样品。由图6结果可见，提取3个大豆毛油样品的基因组DNA后进行常规PCR，未检测到外源转基因成分，且大豆内源基因Lectin也未检测到。同样，由图7结果可见运用荧光定量PCR也未检测到外源转基因成分及大豆内源基因Lectin。

注：1、2、3、4泳道分别检测Lectin基因(118 bp)、CaMV35S启动子(195 bp)、NOS终止子(165 bp)、EPSPS基因(320 bp)；Marker从上至下依次：100、200、300、400、500、700、1 000 bp。

图7 荧光定量PCR检测A、B、C毛油样品外源基因

图7为检测Lectin基因、CaMV35S启动子、NOS终止子、EPSPS基因的荧光定量PCR扩增曲线，横坐标表示扩增循环数，纵坐标表示反应样品的荧光信号强度；Ct值为25的4个扩增曲线分别为4个基因的阳性对照。

3 讨论与结论

2017年6月14日，我国农业农业部公布了《2017年农业转基因生物安全证书(进口)批准清单》，批准16个转基因产品进口，用途皆为“加工原料”，其中包括5个转基因大豆品种。随着大豆等转基因作物进入我国市场及百姓的视野和餐桌，为了给国家监管部门制定相关制度和政策提供可靠的技术支撑，同时，强化转基因成分检测技术储备，保障公众对于转基因食品的知情权，必需研发精确、有效、快速的转基因检测技术。

大豆油在生产过程中，先后经过多次高温、脱水、中和等步骤，大豆DNA在此过程中已被严重降解，大豆油中DNA含量较低，用传统的转基因检测方法很难得到真实可信的结果。本研究利用灵敏度和准确度更高微滴式数字PCR技术，完成了3份大豆毛油的外源转基因成分检测，确定了其中1份样品含有外源转基因成分。针对大豆毛油样品中DNA含量较低、降解严重的特点，本研究首先优化了大豆毛油样品的DNA提取方法，减少DNA在提取过程中的损失，并用较多量的毛油样品提取DNA以提高其浓度；其次，所选的外源转基因目的片段尽量短且为GC含量高的区域，以防毛油样品中的DNA降解。通过方法的优化，成功的检测到了大豆毛油样品中的外源转基因成分，由此建立了一套微滴式数字PCR方法检测大豆毛油中转基因成分的技术标准。同时，运用本方法对市售的精炼大豆油样品的外源转基因成分检测工作正在开展。未来，随着数字PCR技术平台的发展，其成本将会更低，通量更高，在植物油的转基因成分检测领域将发挥更重要的作用。