肝移植受者抗乙肝主动免疫构建与Th17及Treg细胞占比变化的相关性

窦古枫，朱雄伟，陈新国，卢实春，李 威，侯 娜，肖 桦，游 波，宋 军，牛玉坚,

接种乙肝疫苗是预防乙肝病毒感染最重要的措施[1,2]。对于乙肝相关性肝病而行肝脏移植的患者，诱导其产生抗乙肝主动免疫具有重大临床意义[3,4]。本课题组的前期研究发现，外周血Th2细胞在CD4+细胞中占比升高与抗乙肝主动免疫构建成功率升高有关[4]。本研究在此基础上进一步探讨了外周血Th17细胞和Treg细胞在淋巴细胞中占比变化与抗乙肝主动免疫构建的关系，为提高构建抗乙肝主动免疫成功率提供理论支撑和临床经验。

1 对象与方法

1.1 对象 选取2015-02至2017-06在我院随访诊疗的肝移植受者144例。其中，男127例，女17例，中位年龄41.4(18～68)岁，术后中位时间为43.4(18～85)个月。纳入标准[5]：(1)年龄18～68岁；(2)术前HBsAg阳性；(3)入组时HBsAg阴性；(4)肝移植术后时间累计超过18个月；(5)6个月内反应肝功能指标在正常范围内，有升高者不超过正常值2倍；(6)入组前10 d之内不存在发热等提示感染的情况；(7)乙肝免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIg)使用剂量为不超过800 U/月，维持血清抗-HBs滴度在60(±10) mU/ml，并能够持续超过3个月；(8)术后持续服用核苷(酸)类似物[nucleos(t)ide analogues，NAs]。排除标准[5]：(1)对接种乙肝病毒疫苗过敏者；(2)妊娠期或者哺乳期女性；(3)合并其他肝脏相关病毒感染者。所有研究对象均签署知情同意书，均为心脏死亡供肝肝移植。此研究经医院伦理委员会审查批准。

1.2 分组 按照预先的编码随机分为四组，每组36例。(1)传统组：入组后当天、第1个月、第6个月各接种疫苗1次，每次肌肉注射20 μg；(2)传统加强组：入组后当天、第1个月、第6个月各接种疫苗1次，每次肌肉注射60 μg；(3)快速组：入组后当天、第1个月、第2个月、第3个月各接种疫苗1次，每次肌肉注射40 μg；第4个月、第5个月、第6个月各接种疫苗1次，每次20 μg；(4)胸腺肽组：入组后当天、第1个月、第2个月、第3个月各接种疫苗1次，每次肌肉注射40 μg；第4个月、第5个月、第6个月各接种疫苗1次，每次肌肉注射20 μg，本组同时皮下注射胸腺肽6个月， 10 d/次，每次1.6 mg。

1.3 试验药品 (1)乙肝疫苗：上海葛兰素史克生物制品有限公司，20 μg/支；(2)胸腺肽：Patheon Italia S.P.A(意大利蒙沙培森药厂)，1.6 mg/支。

1.4 NAs与HBIg治疗方案[5]NAs按照原有方案一直延续使用至接种前。HBIg延续接种之前方法，若接种疫苗以后，抗体滴度达到了基础值的两倍，那么就停止继续输注HBIg。

1.5 Th17细胞及Treg细胞占比测定 按照流式细胞仪[6]所讲述的方法，采用BriCyte E6流式细胞仪及相关试剂，测定淋巴细胞中Th17细胞及Treg细胞百分比。

1.6 抗乙肝主动免疫构建成功的判定标准[5]研究期间，血清抗-HBs滴度升高至基线水平两倍或以上而停用HBIg后抗-HBs滴度持续≥60 mU/ml至少3个月。

1.7 随访管理 (1)从接种疫苗开始，每个月检测下列指标：血清抗-HBs滴度、血常规、ALT、AST、免疫抑制剂药物浓度；(2)在入组前和实验结束后检测下列项目：肝功能、肾功能、血清抗-HBs浓度、淋巴细胞亚群、免疫抑制剂药物浓度、Th17细胞和Treg细胞占比淋巴细胞数值。

2 结 果

144例中，有2例在研究过程退出(1例定居国外，1例自动放弃，均为男性)，有效样本量为142例。

2.1 抗乙肝主动免疫构建成功率 传统组、传统加强组、快速组和胸腺肽组成功率分别为2.78%(1/36)、5.56%(2/36)、22.9%(8/35)和34.3%(12/35)。与传统组相比，传统加强组增长差异无统计学意义(χ2=0.348，P=0.555)，而快速组与胸腺肽组增长显著(χ2值分别为6.464和11.779，P值分别为0.011和0.001)。

2.2 血清抗-HBs滴度变化情况 试验前血清抗-HBs滴度的基线值在四组间差异无统计学意义(P=0.413)。试验后与试验前相比，传统组有增加但无统计学意义(P=0.079)，其余三组均有显著增加(P值分别为0.017、0.002和0.000)。与传统组相比，另外三组增幅均显著大于传统组(P值分别为0.032、0.005和0.000，表1)。

2.3 Th17细胞占淋巴细胞百分比的变化情况 试验前Th17细胞占比在四组间差异无统计学意义(P=0.984)。四组病例试验后较试验前Th17占比均显著降低(P值分别为0.014、0.000、0.000和0.000)。与传统组相比，另外三组降幅均显著大于传统组(P值分别为0.000、0.001和0.000，表1)。

2.4 Treg细胞占淋巴细胞百分比的变化情况 试验前血清Treg细胞占比在四组间差异无统计学意义(P=0.451)。试验后与试验前相比，传统加强组稍有升高而另外三组稍有下降，但变化均无统计学意义(表1)。

表1 四组肝移植受者试验前后抗-HBs滴度、Th17占淋巴细胞百分比及Treg占淋巴细胞百分比变化情况

注：与传统组比较，①P<0.05

2.5 抗-HBs滴度增幅与Th17降幅相关分析 将本组142例有效病例试验前后血清抗-HBs滴度增幅与外周血Th17细胞占比降幅进行相关性分析，结果显示二者呈显著正相关(r=0.276，P=0.002，表2)。

表2 四组肝移植受者试验前后抗-HBs增幅与Th17降幅相关性

2.6 安全性指标分析 血常规、肝功能、肾功能、血糖、血脂、免疫抑制药血药浓度和淋巴细胞亚群等检测指标在实验前后变化无统计学差异，观察期间未出现排斥反应。

3 讨 论

乙肝相关性肝病肝移植受者接种乙肝疫苗意义重大[7]，在没有使用NAs或HBIg的情况下，乙肝复发率接近100%，乙肝复发将严重影响肝移植预后[8]，故乙肝相关性肝病曾被视为肝移植禁忌证。将NAs和HBIg应用于临床后，肝移植后乙肝复发得到了有效的控制，文献[9]称5年复发率可以降低到在5%以下。NAs和HBIg的联合使用在患者身心健康、经济压力、不良反应等方面存在很多弊端[4,9-11]，需要不断探索创新有效的预防方法。本课题组在前期工作的研究中，采用了不同的免疫接种方法，使疫苗的构建成功率从传统接种方法的2%左右逐步提高到了33.3%[4,5]。本次研究结果显示成功率达34.3%，进一步验证了课题组接种方法的稳定性。这在一定程度上解决了临床难题，但成功率尚不能满足临床需求，需要进一步深入研究，以使成功率进一步提高。

Th17细胞为CD4+辅助性T细胞[12]，是一类促炎性反应细胞亚群，通过分泌致炎因子IL-17参与自身免疫疾病与感染的调控[13,14]。炎性反应是宿主对感染的一种有益反应，但反应过度会导致炎性疾病，也会抑制免疫功能[15]。有研究发现乙肝疫苗不应答与Th17细胞积累有关，即Th17细胞的增多抑制了抗体的生成[16]。笔者的研究结果显示，Th17细胞降幅与抗-HBs滴度增幅呈显著正相关，这不仅从反面印证了上述报道，还提示了Th17细胞占比的降低弱化了对免疫系统的抑制从而促进了抗体生成。Treg细胞属于抑制性T细胞，通过分泌IL-10发挥较强的免疫抑制效应，弱化机体特异性免疫，并在维持免疫耐受方面发挥重要作用，能使抗原的刺激无法激活T、B细胞而产生免疫应答[17-19]。本研究试验后与试验前相比，全部四组受试者中有三组血清抗-HBs滴度有显著增加，而四组的Treg细胞占比均无显著性变化，提示抗-HBs变化与Treg细胞占比无相关性，这与文献报道不同，可能与样本量不足或免疫抑制药的使用在一定程度上影响了Treg细胞的变化有关。Th17细胞与Treg细胞具有相互刺激作用， Chen等[20]研究表明，Treg细胞能够促进Th17细胞的体内、外分化并增强其功能，而Th17细胞是刺激和支持体内Treg细胞增殖和表型稳定的最有力因素。

对于乙肝相关性肝病肝移植受者，构建抗乙肝主动免疫具有重要意义。目前的研究尽管使构建成功率得到大幅度提升，但仍不能满足临床需求，需进一步深入研究以使成功率进一步提高。由于Th17细胞对疫苗接种成功率存在调节的作用，若在接种疫苗之前利用相应的措施去降低体内Th17细胞比例，那么对主动免疫的构建将起到积极的促进作用，这为今后研究方向提供了一个创新思路。