髓样细胞触发受体-1基因rs9471535单核苷酸多态性与男性早发冠心病的相关性

杨 勇，孟涛疆，马东星，刘 英，沈志奇，黄 洁，赵 清，王冉冉，杨长春

近年来，冠心病(coronary artery disease, CAD)的发病率和死亡率在我国持续上升，其中男性CAD患者比例明显高于女性，且均呈现发病年轻化趋势[1]。目前，临床上根据CAD发病流行病学调查结果将男性CAD发病年龄≤55岁称为早发冠心病(premature coronary artery disease, PCAD)[2]。相较于女性PCAD患者发病仍受月经周期期间体内激素水平变化影响，男性PCAD的发病过程中遗传因素发挥着重要作用，而关于遗传机制方面的研究报道相对较少。研究发现，冠心病的主要病理基础是动脉粥样硬化，是一种进展性动脉壁增厚的慢性炎性反应过程[3]。而髓样细胞触发受体-1(triggering receptor expressed on myeloid cells-1，TREM-1)在一系列研究中显现出其对炎性反应及氧化应激反应的调控效力[4-7]。2014年，Golovkin等[8]以俄罗斯人群为研究对象探讨了TREM-1基因以rs9471535为代表的若干SNP位点与CAD发病的相关性，结果显示其与CAD发病显著相关。但是目前国内尚无这方面报道。本研究旨在探讨TREM-1基因rs9471535位点与男性PCAD发病的相关性。

1 对象与方法

1.1 对象 选择原武警总医院心内科2015-08至2017-01收治的男性住院患者(年龄≤55岁)，经冠状动脉造影确诊CAD的患者纳入PCAD组，选择冠状动脉造影或冠状动脉CTA排除CAD的健康对照者纳入对照组。CAD的诊断标准为：冠状动脉造影显示3支主要冠状动脉(左前降支、左回旋支及右冠状动脉)中至少有1支狭窄程度≥50%并符合2008年美国心脏协会颁布的冠心病诊断标准。

1.1.1 纳入标准 (1)年龄18～55岁；(2)北方地区(出生、成长并久居于北方地区)汉族人群，且相互间无血缘关系；(3)符合冠状动脉造影或冠状动脉CTA检查指征并完成冠状动脉造影或冠状动脉CTA检查；(4)患者知情同意，自愿参加。

1.1.2 排除标准 (1)严重肝、肾功能异常或凝血功能异常者；(2)围术期有明显消化道出血，30 d内有活动性出血病史或对抗凝药物存在过敏体质及明显禁忌；(3)对造影剂过敏者；(4)入院血常规检查血小板计数<100×109/L或>300×109/L，白细胞计数<4×109/L或>10×109/L；(5)患肿瘤性疾病且预期寿命小于3个月者。收集患者的一般情况及冠心病相关的临床资料，包括年龄、冠心病史、糖尿病史、高脂血症病史、吸烟史。

1.2 实验步骤

1.2.1 DNA提取 本研究提取基因组DNA采用上海捷瑞生物工程有限公司提供的血液基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)。

1.2.2 DNA引物 TREM-1基因rs9471535[C/T]位点信息如下：TTTTAAATTTAAATAAAAAGATTCC[C/T]ACTGCTAAATAAACAAAAAAATAAC；上下游引物见表1；扩增片段长度为244 bp，GC碱基比例为31.97%。

表1 rs9471535单核苷酸多态性位点引物序列

注：TREM-1：triggering receptor expressed on myeloid cells-1

1.2.3 PCR反应体系及反应条件 反应体系的组成成分如下：基因组DNA，1 μl；10×buffer，1.5 μl；MgCl2(25 mM)，1.5 μl；DNTP(10 mM)，0.3 μl；引物(10 p)，0.15 μl；Taq酶(5 U/μl)，0.3 μl；H2O，补至15 μl。PCR扩增条件：预变性94 ℃，3 min，变性94 ℃，30 s，退火55 ℃，30 s，延伸72 ℃，90 s，变性、退火、延伸35 cycles，再次延伸72 ℃，3 min。

1.2.4 连接酶检测反应(ligase detection reaction, LDR) LDR反应体系如下：PCR产物，3 μl；10×Taq DNA ligase buffer，1 μl；Taq DNA ligase(40 U/μl)，0.125 μl；探针(10 p)，0.01 μl；H2O，补至10 μl。LDR连接条件：94 ℃反应30 s；56 ℃，3 min，共30个循环。取1 μl的连接反应产物，加入8 μl的加样缓冲液HiDi(高度去离子甲酰胺)以及2 μl的Marker，混匀后在95 ℃下变性3 min，立即冰水浴，然后加样到ABI 3730XL测序仪中进行毛细管电泳。最后通过判读电泳结果对目的SNP位点进行分型。

2 结 果

2.1 一般资料比较 研究最终收集男性PCAD患者121例，平均(47.47±5.47)岁；对照组196例，平均(45.77±6.35)岁。PCAD组高血压病史、糖尿病、高脂血症及吸烟患者比例均高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。

表2 PCAD组与对照组人口统计学及临床资料比较 (n;%)

2.2 基因分型毛细管电泳峰图 图1为ABI 3730XL测序仪中毛细管电泳基因分型检测结果：A为TT基因型，B为CC基因型，C为CT基因型。

图1 rs9471535位点毛细管电泳图

2.3 TREM-1基因rs9471535多态性分析 研究人群中TREM-1基因rs9471535位点基因型的分布符合 Hardy-Weinberg 遗传平衡定律。统计分析发现，基因型(CC/CT/TT)组间分布有统计学差异(P=0.017)，等位基因组间比较无统计学差异(P=0.720，表3)；单因素分析表明，与TT基因型相比，rs9471535位点CC基因型在PCAD组与对照组间的分布无统计学差异；多因素分析结果显示，rs9471535位点CC基因型在PCAD组与对照组间的分布有统计学差异(P=0.011，表4)。

表3 两组PCAD患者rs9471535(C/T)SNP基因型和等位基因频率 (n; %)

表4 TREM-1基因rs9471535多态性与PCAD相关性Logistic回归分析

3 讨 论

髓样细胞触发受体(triggering receptor expressed on myeloid cells, TREM) 是一类表达于免疫系统髓样细胞的免疫球蛋白超家族。在这一免疫球蛋白超家族中，目前研究较多的成员包括TREM-1、TREM-2、TLT-1及TLT-2等。其中，TREM-1是最早于2000年被发现并报道的受体蛋白[9]。而编码人的TREM-1基因位于6p21.1，长度约为19 kb，由6个外显子和5个内含子组成。研究表明，TREM-1通过调节白细胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)[10,11]和NF-κB[12-14]等炎性因子活性，进而触发和扩大炎性反应中各种炎性因子级联效应，在固有免疫和适应性免疫中起着重要的调节作用，可能参与了动脉粥样硬化的病理过程[15]。

本研究发现，rs9471535位点在研究人群中分布符合 Hardy-Weinberg 平衡定律，提示本研究所选择的样本具有较好的人群代表性。初步统计分析发现，两组间三种基因型(CC/CT/TT)分布明显不同，差异有统计学意义，提示TREM-1基因rs9471535位点可能与PCAD发生相关。经Logistic回归，进一步校正两组间冠心病的一些传统危险因素(高血压、糖尿病、高脂血症及吸烟)后，结果仍然显示该SNP位点CC基因型相较于TT基因型而言，对PCAD发生起保护性作用，也就是说，携带CC基因型的男性患者出现PCAD的风险相较于TT或TC基因型更低。继我课题研究组吕强等[16]2017年完成相关TREM-1基因与冠心病发病相关研究后，国内陆娇等[17]于2018年亦进行了TREM-1基因与冠心病发病的群体遗传学报道。该报道提示rs9471535位点可能与冠心病发病相关，特别是与急性冠脉综合征(ACS)密切相关。两研究在疾病发病的群体遗传学趋势上是一致的。上述研究结果与国外Golovkin 等[8]报道的结果相近，即rs9471535与冠心病发生相关。但是，国外研究认为，携带CC基因型人群发生冠心病的风险可能会增高。研究人群种族各异、基因分型方法不同，以及与所选研究人群主要集中在中国北方地区等，可能是造成上述研究结果间差异的主要原因。

综上所述，本研究于国内率先就rs9471535位点与男性PCAD发生的相关关系进行了比较，发现CC基因型在研究人群中分布有统计学差异，携带CC基因型的人群发生PCAD的风险相对较低。另外，本研究为横断面研究，仅入选研究期间的男性PCAD患者，且研究对象相对较少、样本量有限，选取的研究人群主要为中国北方地区，因而其结果不能完全代表中国大陆汉族人群PCAD的全部特点，结果的外延性受到限制。上述局限性也促使有必要进行更大规模的流行病学调查分析，从而为男性PCAD的发病机制提供理论依据。

(致谢：感谢中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供的技术及专业指导)