高效液相色谱串联质谱法测定乳粉中低聚半乳糖

甄振鹏，高裕锋*，黄敏兴，庞扬海，王小鹏，李硕聪，余构彬

（1广东省生物工程研究所（广州甘蔗糖业研究所） 广东省甘蔗改良与生物炼制重点实验室，广东广州510316；2国家糖业质量监督检验中心，广东广州510316）

0 引言

棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖是 α-1,6-糖苷键连接的低聚半乳糖（Galactooligosaccharides，GOS）[1]。棉籽糖的分子结构是蔗糖靠近葡萄糖一侧以 α-1,6-糖苷键连接一个半乳糖，属于三糖。水苏糖是棉籽糖靠近半乳糖一侧以α-1,6-糖苷键连接一个半乳糖，属于四糖。而毛蕊花糖则是在水苏糖末端半乳糖再以α-1,6-糖苷键连接一个半乳糖，属于五糖[2]。

棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖具有促进肠道有益菌生长，促进消化吸收，改善脂质代谢，降低血脂和胆固醇，促进钙和镁等矿物元素的吸收，提高免疫力等生理功能，因此常被添加到各类功能性食品中[3]。尤其是在婴幼儿乳粉中，往往人为添加低聚半乳糖，以模拟人乳中含有低聚半乳糖的状态，起到促进婴幼儿的消化吸收作用。棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖是低聚半乳糖的重要组成品种。

目前，国内并没有完善成熟的检测乳粉中棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖的标准，这使得相关指标的监管缺失，不利于保障乳制品的质量安全。因此，开发乳粉中棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖的检测方法，具有重要的意义。

利用高效液相色谱配示差检测器或蒸发光散射检测器以及离子色谱检测棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖已有一些文献报道[4-7]。如目前国内已发布的国家标准GB/T 22491-2008《大豆低聚糖》涉及了棉籽糖和水苏糖的检测方法[8]。利用高效液相色谱串联质谱法开发牛奶中低聚半乳糖及其他低聚糖是近年来研究的热点[9-11]，它可以实现准确定性和定量的目的。本文拟利用高效液相色谱串联质谱法结合前处理方法的研究，开发一种乳粉中棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖的测定方法，并将其用于实际样品检测中。

1 实验材料和方法

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱串联质谱仪（液相：日本岛津公司LC-20AD；质谱：美国 ABI公司，4000Q trap）；Milli-Q超纯水器（美国Millipore公司）；Vortex-Genie 2涡旋混匀器（奥然科技有限公司）；电子天平（0.1 mg，日本AND公司）。

棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖标准品购自于日本Wako公司；甲醇（色谱纯，美国默克公司）；乙腈（色谱纯，美国默克公司）；有机相滤膜购于天津博纳艾杰尔科技公司。

实验所用的 33种乳粉样品为市场中随机购买的产品。

1.2 标准溶液配制

分别精确称取棉籽糖、水苏糖、毛蕊花糖各10 mg置于100 mL容量瓶中，用蒸馏水超声溶解定容至刻度，作为混合标准储备液备用。将此混合标准储备液用空白基质提取液逐级稀释，分别配成低聚半乳糖标准品浓度为 1500、1000、500、200、100和50 μg/L的混合标准溶液。

1.3 提取和净化

称取乳粉样品1 g（精确至0.01 g）于50 mL比色管中，加入30 mL蒸馏水溶解（充分振荡），再用20 mL无水乙醇定容至50 mL，涡旋振荡，超声20 min，移取约25 mL溶液于50 mL离心管中，以8000 r/min离心5～10 min，离心机温度10℃，精密移取上清液过0.22 μm水相滤膜至进样瓶中，取滤液进行高效液相色谱串联质谱检测。

1.4 HPLC-MS/MS分析

1.4.1 HPLC条件

色谱柱：XBridgeTMAmide （150 mm×4.6 mm×3.5 μm）；流动相 A：40/60的乙腈/水溶液含 0.10%氨水溶液，流动相B：70/30的乙腈/水溶液含0.10%氨水溶液；梯度洗脱：0～30 min 0%～40% A；30～33 min 40%～60% A；33～35 min 60% A；35～37min 60%～0% A；37～38min 0% A。

流速：0.4 mL/min；柱温：40℃；进样量：5 μL。

1.4.2 质谱条件

电离模式：ESI-；仪器参数：气帘气压力344.5 kPa，碰撞气压力中档，离子喷雾电压 4500 V，离子源温度550℃，雾化气压力344.5 kPa，辅助加热气压力344.5 kPa，接口加热器为开；采集模式：多反应监测MRM，具体参数如表1所示。

2 结果与分析

2.1 色谱和质谱条件的选择

由于低聚半乳糖水解电离都能产生各种单糖双糖离子，质谱无法分离，因此对于色谱分离要求高，才不造成相互影响（见图1）。采用检测糖类专用的氨基柱，单纯使用乙腈水流动相无法将各种低聚半乳糖有效分离。通过考察不同流动相比例对检测分离效果的影响，发现以 40/60的乙腈/水溶液（水中含0.10%氨水）作为A相，以70/30的乙腈/水溶液（水中含0.10%氨水）作为B相，按照1.4.1的洗脱方式，可以实现有效的分离，并且提高负离子模式下的灵敏度。

质谱条件优化方法是：在注射泵直接进样的条件下，在负离子模式下进行母离子全扫描，确定低聚半乳糖的分子离子峰，然后以该分子离子峰为母离子，对其子离子进行全扫描，获得二级质谱响应较强的子离子，最后以多反应监测模式进行采集，并获得去簇电压和碰撞能量等相关参数，具体参数如表1所示，使所测的质谱峰强度最优。

2.2 沉淀溶剂的选择与优化

表1 3种低聚半乳糖保留时间与多反应监测条件

图1 3种低聚半乳糖（1000 μg/L）标准溶液的总离子色谱图

由于低聚半乳糖属于水溶性多糖，因此采用超纯水进行提取，但乳粉中易溶于水的物质多，尤其是蛋白质含量高，对检测造成很大的干扰，因此需要进行一些预处理，降低干扰。本文分别使用无水乙醇、三氯乙酸∶乙酸铅、乙腈作为蛋白质沉淀剂，比较其沉淀效果。结果表明，用无水乙醇沉淀蛋白质的效果优于用三氯乙酸∶乙酸铅、乙腈沉淀蛋白质的效果。通过比较6∶4、5∶5、4∶6的无水乙醇∶水溶液的提取效果，结果发现4∶6的无水乙醇∶水溶液的提取效果明显优于其他2种，因此采用此溶剂作为提取溶剂。

2.3 方法线性范围和检出限

用50～1500 μg/L标准工作溶液进样分析，根据标准物质浓度（x）和峰面积（y）计算的线性方程见表2。结果表明，3种低聚半乳糖标准曲线的相关系数为0.9986～0.9997，线性良好。方法检出限（LOD）以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比 S/N=3计算得出。定量限（LOQ）以空白样品基质稀释标准曲线上的最低浓度出峰时，取信噪比S/N=10计算得出。结果如表2所示，可以满足3种低聚半乳糖痕量分析的需要。

2.4 回收率和精密度

表2 3种低聚半乳糖的方法检出限、定量限、线性范围、线性方程和相关系数

分别准确添加3种低聚半乳糖标准溶液于空白乳粉样品中，设 3个添加浓度，每个浓度分别做 6次重复实验，按上述方法测定，以得到的平均回收率评价分析方法的准确度，以6次测试结果的相对标准偏差评价方法的精密度。添加水平为100、500、1000 μg/kg，平均添加回收率在80.8%～86.6%之间，相对标准偏差小于 8%（见表 3），均在允许范围内，符合残留分析的要求。

表3 乳粉中3种低聚半乳糖平均回收率和精密度数据表（n=6）

2.5 实际样品测试

为了验证该实验方法在实际样品检测中的应用，本文检测了市面上33种不同乳粉的低聚半乳糖含量，结果如表4所示。实际样品检测结果表明，毛蕊花糖的添加量是最少的，大多低于10 mg/kg，但都会存在于各大品牌的乳粉中，棉籽糖和水苏糖添加量相对较多，但是基本情况是棉籽糖添加量多，则水苏糖就添加少量或者不添加。

3 结论

通过对前处理方法和色谱质谱条件的优化，建立了乳粉中低聚半乳糖的高效液相色谱串联质谱检测方法，该方法简单、快速、准确，可实际应用于乳粉中低聚半乳糖的批量检测，能有效提高工作效率、降低分析成本。实际样品检测结果表明，毛蕊花糖的添加量是最少的，但都会存在于各大品牌的乳粉中，棉籽糖和水苏糖添加量相对较多，但是基本情况是棉籽糖添加量多，则水苏糖就添加少量或者不添加。