设计优化微波辅助法提取草石蚕中水苏糖

栾凯雯，贺梦瑶，刘佳欣，汤兴楠，朱建星，张万忠

沈阳化工大学制药与生物工程学院（沈阳 110142）

水苏糖是在唇形科、豆科、玄参科等多种植物中存在的功能性低聚糖，其中在草石蚕中含量最高。水苏糖分子式为C24H42O21，分子量666.59，属于低聚半乳糖，被誉为“超强双歧因子”，被广泛用于食品、医药等领域[1-2]。 水苏糖对肠道有益菌如双歧杆菌、乳杆菌有特异性的增殖作用[3]，每天摄入0.5～3 g水苏糖即有效果[4]。水苏糖能增加机体对矿物元素的吸收，被认为与盲肠中的L-乳酸的提高有关[5]。

微波辅助提取法具有快速高效、节省溶剂、工艺简单、应用面广泛等特点[6-10]。此次试验采用微波辅助法对干品草石蚕中水苏糖进行提取，借助响应曲面以水苏糖提取率为响应值，对微波辅助提取草石蚕中水苏糖的工艺进行优化（微波功率、微波时间、微波温度和料液比），得到最优的提取条件。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

草石蚕干品（亳州市康易饮生物科技有限公司）；蒸馏水；水苏糖标准品（纯度98%，广东深圳润慧生物科技有限公司）；乙腈（色谱纯，德国SIMARK）。

GB1302型电子精密天平（梅特勒托利多仪器公司）；Agilent1200高效液相色谱仪；Mars6微波消解仪[培安CEM微波化学（中国）技术中心]；小型高速粉碎机（北京兴时利和科技发展有限公司）；SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市予华仪器责任公司）。

1.2 试验方法

1.2.1 水苏糖标准溶液的配制

称取100 mg水苏糖标准品溶于10 mL容量瓶中，加入蒸馏水溶解定容到10 mL，此时得到10 mg/mL的标准品溶液，将此标准溶液逐级稀释成8，6，4和2 mg/mL的标准溶液，经孔径0.45 μm微孔膜过滤后待用。

1.2.2 水苏糖标准曲线的绘制

将过膜后不同浓度的水苏糖标准品分别利用高效液相法[11-14]进行分析，进样量均为20 μL，每种浓度标准品重复进样3次，取平均值，以水苏糖的浓度（X，mg/mL）与它们对应的峰面积（Y）进行线性回归，绘制水苏糖的标准曲线，得到水苏糖标准曲线Y= 58 017.1X-43 538.4，R2=0.999 5。

1.2.3 色谱条件

色谱柱，TIANHE Kromasil NH2柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为V乙腈∶V水=70∶30；流速1 mL/min，柱温40 ℃，进样量20 μL。

1.3 水苏糖的提取工艺及提取率测定

草石蚕干品粉碎过0.150 mm（100目）筛，得到草石蚕干品粉末，称取若干份草石蚕粉末，以微波辅助法提取，抽滤得到上层溶液后过膜进样，计算草石蚕中水苏糖含量。水苏糖提取率按式（1）计算。

式中：n为稀释倍数；V为提取液体积，mL；Q为提取液水苏糖含量，mg/mL；W为干粉质量，g。

1.4 单因素试验

选择料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 mg/mL）、提取温度（40，50，60，70和80 ℃）、提取时间（2，4，6，8和10 min）、微波功率（200，300，400，500和600 W）进行单因素试验，考察其对草石蚕中水苏糖提取率的影响。

1.5 响应面优化试验

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，采用Design-Expert软件，以水苏糖提取率为影响值进行响应曲面优化，响应面因素和水平见表1。

表1 响应面因素和水平表

1.6 数据分析

通过SPSS 17.0软件统计进行数据方差分析，p＜ 0.01表示差异具有显著统计学意义，试验结果用作图软件Origin 9.0绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 料液比对水苏糖提取率的影响

在提取温度50 ℃、提取时间4 min、微波功率400 W的条件下，料液比对水苏糖提取率的影响如图1所示。随着液体比例不断增加，提取率不断增加，料液比1∶25 mg/mL时达到最大值，因为随着溶液体积分数增加，草石蚕干品与溶液得到充分接触，使得水苏糖溶解率增加。料液比超过1∶25 mg/mL时，水苏糖的溶解度达到饱和，其他杂质溶出影响水苏糖的溶出，使得提取率下降。故料液比1∶25 mg/mL最合适。

图1 料液比对水苏糖提取率的影响

2.1.2 提取温度对水苏糖提取率的影响

在料液比1∶25 mg/mL、提取时间4 min、微波功率400 W的条件下，提取温度对水苏糖提取率的影响如图2所示。随着提取温度不断增加，提取率不断增加，提取温度60 ℃时达到最大值，当温度继续增加时，水苏糖得率不断下降，可能是因为温度短时间内迅速升高加速其他杂质大量溶出，阻碍水苏糖的溶出。故提取温度选择60 ℃最合适。

图2 提取温度对水苏糖提取率的影响

2.1.3 提取时间对水苏糖提取率的影响

在提取温度60 ℃、料液比1∶25 mg/mL、微波功率400 W的条件下，提取时间对水苏糖提取率的影响如图3所示。随着提取时间增加，水苏糖得率先增加后下降，在6 min时得率达到峰值，8 min时开始下降，可能是使用微波提取时间过长会引起水苏糖结构的破坏，故提取时间6 min最合适。

图3 提取时间对水苏糖提取率的影响

2.1.4 微波功率对水苏糖提取率的影响

在提取温度60 ℃、提取时间6 min、料液比1∶25 mg/mL的条件下，微波功率对水苏糖提取率的影响如图4所示。微波功率对水苏糖的提取影响较大，随着微波功率增加，提取率大幅增加，400 W时达到最大值。原因可能是随着微波功率增加，分子运动逐渐剧烈，增加了水苏糖的溶出，微波功率继续增大，微波产生的强烈作用使水苏糖结构遭到破坏，提取率下降。故微波功率选择400 W最合适。

图4 微波功率对水苏糖得率的影响

2.2 响应面优化试验结果

2.2.1 回归模型的构建及方差分析

水苏糖提取设计方案及结果见表2，回归方差分析见表3，拟合所得多元二次回归方程：Y=41.23+ 0.51A-0.13B-0.23C+0.036D-1.18AB-0.70AC+7.500E-003AD+0.38BC+0.48BD+0.12CD-1.07A2-1.88B2-2.50C2-1.32D2。

表2 响应面试验设计和试验结果

由表3可知，该回归模型达到极显著水平（p＜ 0.01），失拟项不显著，R2=0.916 0，表明该模型的拟合程度较好，水苏糖的提取率可以用该模型进行分析和预测。通过对比表3中的F值可以得出，影响水苏糖提取率的主次顺序为A＞C＞B＞D，即提取功率＞提取温度＞提取时间＞料液比。

表3 回归模型方差分析表

2.2.2 各因素间的交互作用

根据回归方程做出的各两因素交互作用的响应面分析见图5。微波功率（A）和提取时间（B）交互（AB）的影响显著。

图5 各两因素交互作用响应面

2.2.3 最优条件的确定及验证试验

用Design-Expert 8.0.6软件对二次多项式回归方程进行计算，得到提取水苏糖的最佳工艺条件：微波功率400 W、提取时间5.6 min、提取温度60 ℃、料液比1∶25 mg/mL。水苏糖提取率的理论最优值是41.35%。参照试验条件进行验证试验，得到的水苏糖提取率为41.18%，与理论值的相对误差为0.17%，说明该方法具有一定可操作性。

3 结论

以响应曲面法来优化微波辅助法提取水苏糖条件，确定最佳提取条件：提取时间5.6 min、提取温度60 ℃、微波功率400 W，料液比1∶25 mg/mL，水苏糖的提取率可达41.18%。综上，利用响应曲面法对草石蚕中水苏糖的提取工艺进行优化的方法是科学的，为从草石蚕中提取水苏糖以及对水草石蚕中水苏糖的开发利用提供了理论依据。