益气活血方对气虚血瘀型心衰大鼠NT-proBNP、Caspase-3 的影响

邢俊娥，吴 鹏，陈 妃，谢小红

（广西中医药大学第一附属医院，广西南宁530001）

心力衰竭是在多种致病因素作用下引起的心肌损伤，心肌的结构和功能发生一系列改变，导致心输出量绝对减少或相对不足，从而不能满足机体组织细胞代谢需要出现的病理过程，在发病中有明显的临床症状和体征。 慢性心力衰竭（CHF）是指心力衰竭的持续状态，临床上可以表现为稳定期、失偿期或者恶化期，三者之间可以相

互转换。CHF 在心血管系统疾病导致终点事件的发展中占有非常重要的地位，我国每年新增慢性心衰的患者约有200 万［1］。因此，预防和治疗CHF是我们的主要任务，其中治疗的目标主要是针对心肌重构的机制，延缓和防止心肌重构的发展，改善其症状、提高生活质量。

近年来，中医学对于CHF 的研究也十分广泛，罗良涛等［2］对CHF 患者进行统计后分析得出，中医治疗原则主要以益气、温阳、活血、滋阴、利水为主，其中中成药以益气、活血为主，我们根据其“阳气虚衰为本，痰饮、血虚、水湿为标”的病机特点，多年来采用自拟的益气活血方治疗CHF大鼠取得了很好的疗效，现将其对CHF 大鼠NTproBNP、Caspase-3 的影响报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康SD 雄性大鼠60 只，体质量为（180±20）g，购于广西医科大学实验动物中心，合格证号：SYXK 桂2016-0005。动物放置于常温、安静环境饲养，自由饮水，正常喂养，所食饲料均为标准合成大鼠饲料。

1.1.2 实验药物 益气活血方：由广西中医药大学第一附属医院中药房提供。药物组成：党参30 g，黄芪20 g，赤芍15 g，丹参15 g，麦冬10 g，五味子15 g，川芎15 g，茯神15 g，炙甘草8 g。制成含生药1.52 g/mL 的溶液。依那普利片，石药集团欧意药业有限公司生产，批号：国药准字H10980305，规格：10 mg/片。

1.1.3 试剂与仪器 10%水合氯醛（上海联硕生物有限公司：批号：20150412）。大鼠NT-ProBNP ELISA 检测试剂盒（上海源叶生物科技有限公司：批号：20150612）。兔抗大鼠Caspase-3 检测试剂盒（北京博奥森生物技术有限公司：批号：20141123）。Vevo 2100 超声仪MS-250 心脏探头，频率13～15 MHz。离心机（LG16-W 北京医用离心机厂生产）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组与造模 60 只大鼠随机分为益气活血方组、正常对照组、模型组、依那普利组，每组15 只。气虚血瘀型大鼠模型采用中医证候动物模型制备的方法进行制作［3-4］，在实验第1周，分别采用饥饿、疲劳、惊恐、寒冷、潮湿等方法进行诱导。然后采用10%水合氯醛注射麻醉并固定，在剑突下2～3 cm 沿腹白线逐层分别切开皮肤、肌肉至剑突，充分暴露腹腔，将肝脏向上轻推、固定，充分暴露腹膜以及左侧肾脏，延左肾动脉向上移行寻找到腹主动脉，将其鞘钝性分离，将7#针头与腹主动脉平行放置，用外科缝线将腹主动脉与针头结扎，结扎后马上可触及结扎处下方动脉脉搏明显减弱、左肾缺血变白，立即将针头退出（正常对照组仅分离腹主动脉血管鞘，不采取结扎术），脏器复位，缝合切口，手术结束。术后将大鼠置于清洁干燥的环境中，给予正常喂养，并予大鼠青霉素肌肉注射10 000 U/只，连续3 d，预防切口感染。造模结束后观察大鼠变化，主要表现为：活动和进食减少，皮毛干枯无光泽，有腹水，体质量逐渐缓慢增长，上述表现随着时间而更加明显；到第8 周时可出现行动迟缓、对外界刺激反应减慢、呼吸急促、口唇、尾巴出现紫绀等心力衰竭体征，超声心动图检测左室射血分数（LVEF）值低于50%，即为心衰大鼠模型制备成功，检测仪器为Vevo 2100 超声仪MS-250 心脏探头，频率13～15 MHz。

1.2.2 给药 益气活血方组按15 mL/（kg·d）给予益气活血方溶液灌胃，依那普利组给予10 mg/（kg·d）依那普利灌胃，正常对照组和模型组每日给予等量生理盐水灌胃。所有大鼠用药疗程均为8 周。全程密切观察大鼠活动、进食、皮毛、腹水等情况。

1.3 观察指标

所有用药疗程结束后给予禁食12 h，并予水合氯醛腹腔麻醉大鼠，剖开腹腔，在腹主动脉进行采血，4000 r/min 离心10 min，取上清液，低温保存，采用酶联免疫法测定NT-ProBNP 水平，具体步骤按大鼠NT-ProBNP 检测试剂盒说明操作。动脉取血后取其部分心室组织制成细胞均浆，用于免疫组化Caspase-3 检测。2000 r/min 离心20 min，收集上清液。常规石蜡制片、HE 染色，光镜下400 倍放大，随机选取5 个视野，根据染色的面积和强度的乘积，分别计算其免疫组化的评分，最后取平均值作为该片的评分，具体按照Caspase-3 试剂盒说明书操作。

1.4 统计学方法

实验数据以均数±标准差（±s）表示，结果采用SPSS 17.0 统计软件处理，两组间比较采用t检验，多组间两两比较采用LSD法，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠NT-ProBNP、Caspase-3 比较

与正常对照组比较，模型组NT-proBNP 显著升高（P＜0.01）；益气活血方组和依那普利组与模型组比较NT-proBNP 显著降低（P＜0.05）；益气活血方组和依那普利组比较差异无统计学意义。Caspase-3 表达免疫组化检测：模型组阳性心肌细胞表达面积广泛，呈融合分布，胞浆呈棕黄色或棕褐色。正常对照组心肌细胞呈散在分布，仅有少量的标记，胞浆呈淡黄色。益气活血方组和依那普利组阳性细胞染色程度及面积均低于模型组，高于正常对照组。与正常对照组相比，模型组存在心力衰竭时，可诱发心肌Caspase-3 过度表达（P＜0.01）；与模型组相比，益气活血方组和依那普利组均能抑制心肌Caspase-3 表达（P＜0.05）；益气活血方组和依那普利组比较差异无统计学意义，结果见表1。

表1 各组大鼠血清NT-ProBNP、Caspase-3 表达水平比较（x±s）

2.2 大鼠心肌组织形态变化

与正常对照组相比，模型组心肌细胞排列紊乱，胞核着色不均匀，横纹模糊不清，肌纤维疏松肿胀，大量炎性细胞浸润；与模型组相比，益气活血方组和依那普利组心肌细胞排列紧凑，组织形态正常，肌原纤维排列有序，偶见心肌细胞断裂、缺损及炎性细胞浸润。

3 讨 论

关于CHF 发生的机制，目前心肌细胞的死亡学说已越来越多地被认可并开展广泛的研究。魏玲等［5］指出，若按照心肌细胞凋亡速率＞0.1%计算，那么每年将会有大约37%的心肌细胞发生死亡。吴云飞等［6］则认为，细胞凋亡主要有两种形式：内源性和外源性，而这两条途径最终都会通过激活Caspase-3 发挥作用，进一步导致细胞发生凋亡。Caspase-3 在细胞凋亡中具有关键的激活效应，是不可或缺的，同时激活下游的细胞死亡蛋白酶，故细胞的凋亡是不可逆的。因此，抑制心肌重构的首要目的是抑制心肌细胞凋亡，故而我们可考虑，抑制Caspase-3 的激活，可抑制心肌重构的发生。

NT-proBNP 主要存在于心室和脑组织细胞内，是由左心室分泌的脑钠肽（BNP）激素原转化裂解生成，当心脏的容量和压力负荷发生增高时，NT-proBNP 分泌量随着室壁压力升高而逐渐增加。其结构为一直链，不具有生物学活性，在心力衰竭的患者中的浓度较BNP 高1～10 倍，故与BNP 相比，诊断心衰更敏感［7］，加上NT-proBNP具有浓度高、灵敏性强、体外稳定性好、测定方法简便等优点，目前在临床上已广泛用于心力衰竭的诊断和鉴别诊断［8］。

总之，在CHF 的发生、发展阶段中，NT-proBNP及Caspase-3 具有很重要的临床指导价值，观察气虚血瘀型大鼠NT-proBNP、Caspase-3 治疗后的变化，发现益气活血方能降低气虚血瘀型心衰大鼠的NT-proBNP 水平，可能是通过降低Caspase-3 水平来抑制心肌重构的发生，进而促进CHF 恢复。但有研究认为血浆NT-proBNP 水平受肾脏功能影响，与估算肾小球滤过率存在负相关，所以我们的实验心衰大鼠造模采用腹主动脉狭窄术方式，我们还需排除肾脏功能不全的影响，或其他可能影响血浆NT-proBNP 的因素，实验还待进一步完善。