丹参酮ⅡA注射液对缺血缺氧性脑损伤新生大鼠皮质神经元自噬及Akt-mTOR通路的影响*

朱 波 杨 艳 苏仁意 许细平 孙乾朕

（湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院，湖北 襄阳 441000）

缺氧缺血性脑损伤（HIBD）是造成新生儿多种神经功能障碍的疾病之一，严重威胁新生儿生命健康［1］。据调查，围生期HIBD新生儿死亡率高达20%，经治疗幸存患儿中约40%存在脑神经损害等后遗症［2］。目前，HIBD主要依靠亚低温疗法进行治疗，但其预后效果并不理想。相关研究指出，病理性神经元自噬是造成多种神经元损伤凋亡的重要原因之一［3］。因此，寻找调节神经元自噬药物的研究是目前治疗HIBD的新思路。丹参酮ⅡA是丹参主要有效成分之一，难溶于水，易溶于有机溶剂。丹参酮ⅡA因含有醌型结构，具有多种药理药效，例如改善冠状动脉循环、修复心肌损伤、抗细胞凋亡、神经保护等［4］。相关研究显示，丹参酮ⅡA对多种脏器的缺氧缺血性损伤具有保护作用［5-6］。任陈等研究发现丹参酮ⅡA能明显减轻放射线在体外对海马神经元细胞的放射损伤作用，并推测其保护机制可能与调节放疗过程中神经元自噬相关［7］。因此，本研究拟通过建造新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型，观察丹参酮ⅡA对HIBD新生大鼠皮质神经元自噬及Akt-mTOR通路影响并探讨其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 清洁级7日龄SD（Sprague-Dawley）大鼠80，雌雄不计，体质量11.6～12.17 g，平均体质量（11.98±0.32）g，由河南省实验动物中心提供，许可证号：SYXK（豫）2015-0003。

1.2 试剂与仪器 丹参酮ⅡA磺酸钠购自上海上药第一生化药业有限公司，国药准字H31022558，批号160916。蛋白酶抑制剂购自上海子起生物科技有限公司，货号E429-10MG。RIPA裂解液购自北京君诺德生物技术有限公司，货号7011A。BCA蛋白浓度检测试剂盒购自上海经科化学科技有限公司，货号JK-201。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6、GADPH蛋白抗体及HRP缀合的二抗均购自药明康德。透射电子显微镜购自尼康仪器（上海）有限公司。酶标仪购自美国伯腾仪器。

1.3 分组与造模 将SD幼鼠随机分为5组，每组16只，分别为假手术组、模型组、高剂量组（0.1 mg/g）、中剂量组（0.05 mg/g）、低剂量组（0.02 mg/g）。假手术组仅左颈部切口处理，其余各组进行造模。3%乙醚麻醉幼鼠，手术暴露左侧颈主动脉，分离神经，结扎血管，缝合伤口。放回原饲养环境，恢复3 h后，将幼鼠置于常压缺氧舱内，温度37℃，湿度45%～55%，持续通入8%O2和92%N2缺氧处理2.5 h，幼鼠出现左旋即为造模成功。

1.4 给药方法 高剂量组、中剂量组、低剂量组幼鼠分别给予不同剂量的丹参酮ⅡA注射液，于出现左旋现象时腹腔注射1次，24 h后重复注射1次。假手术组与模型组分别按照上述给药方式给予等体积0.9%氯化钠注射液。

1.5 标本采集与检测 1）大脑皮质超微结构观察。缺氧缺血处理32 h后，取幼鼠断头取左脑，利用解剖镜迅速剥离大脑皮质，置于冰上盛有2.5%戊二醛容器中进行处理，用1%锇酸对脑组织进行固定，乙醇和丙酮不同浓度由低至高进行脱水，环氧树脂包埋，切片，利用乙酸双氧铀和硝酸铅染色，置于透射电子显微镜下观察拍片。2）TTC染色观察脑梗死面积。缺氧缺血处理36 h，取幼鼠断头，取左脑置于冰上。Rat Brain Matrix由前之后切片，厚度5 μm。室温条件下，将切片置于2%TTC中，孵育35 min，PBS缓冲液洗涤，10%中性甲醛固定。数码相机采集图片，正常脑组织为红色，梗死组织为白色。利用Image J对采集图片急性分析，统计梗死面积百分比。3）蛋白免疫印迹法检测脑组织自噬蛋白表达。缺氧缺血处理48 h，取幼鼠进行断头取脑，取左侧脑组织，例用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液提取脑组织蛋白。4℃下10 000×g离心8 min后取上清，BCA蛋白浓度检测试剂盒检测总蛋白，10%SDS-PAGE分离胶分离蛋白，半干法转移蛋白至PVDF膜上。PBS配制的5%脱脂乳对膜进行封闭，4℃过夜。弃封闭液，PBS缓冲液清洗膜5次，每次4 min。LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1、p-Akt、p-mTOR、p-S6 蛋白抗体及内参GADPH蛋白抗体作为一抗，室温孵育3 h。弃溶液，PBS缓冲液洗涤5次，每次4 min。室温条件下，HRP缀合的二抗孵育1.5 h。利用Image J软件分析条带灰度，评估蛋白相对表达量。

1.6 统计学处理 应用SPSS20.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，两组间比较行t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组新生大鼠大脑皮质超微结构 见图1，表1。假手术组神经元结构正常，细胞核、线粒体、粗面内质网、高尔基体及溶酶体均正常存在。模型组中观察到皮质神经元中存在大量的自噬体和自噬溶酶体，其泡状自噬体中包裹有可见的细胞质结构。相较于模型组，高剂量组、中剂量组、低剂量组中自噬体数量明显减少，且呈一定的剂量依赖性（P＜0.05）。

图1 各组新生大鼠大脑皮质超微结构（乙酸双氧铀和硝酸铅染色，5000倍）

表1 各组新生大鼠大脑皮质超微结构（x±s）

图2 各组新生大鼠脑梗死组织切片

2.2 各组新生大鼠脑梗死比较 与假手术组比较，模型组中幼鼠大脑皮质、海马等区域呈现明显的大面积白色梗死。与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组中幼鼠脑梗死程度均有所改善。见图2。对各组中幼鼠脑梗死面积进行定量，发现与假手术组比较，模型组中幼鼠脑梗死面积显著增加 （P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组脑梗死面积显著减小，且呈一定的剂量依赖性（P＜0.05）。见表2。

表2 各组新生大鼠脑梗死情况比较（%，x±s）

2.3 各组新生大鼠脑组织自噬蛋白表达情况比较

见图3，表3。与假手术组比较，模型组新生大鼠脑组织中 LC3-Ⅰ/（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）的比值显著增高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组新生大鼠脑组织中LC3-Ⅰ/（LC3-Ⅰ＋LC3-Ⅱ）的比值显著降低，呈剂量依赖性（P＜0.05）。模型组新生大鼠脑组织中Beclin-1蛋白表达水平与假手术组比较显著上升（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组新生大鼠脑组织中Beclin-1蛋白表达水平显著下降，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。

图3 各组新生大鼠脑组织自噬蛋白表达情况

表3 各组新生大鼠脑组织自噬蛋白表达情况比较（x±s）

2.4 各组新生大鼠脑组织中p-Akt表达情况比较

见图4，表4。与假手术组比较，模型组新生大鼠脑组织中p-Akt蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组新生大鼠脑组织中p-Akt蛋白的表达水平显著升高，呈剂量依赖性（P＜0.05）。

图4 各组新生大鼠脑组织中p-Akt表达情况

表4 各组新生大鼠脑组织中p-Akt表达情况比较（x±s）

2.5 各组新生大鼠脑组织中p-mTOR表达情况比较见图5，表5。与假手术组比较，模型组新生大鼠脑组织中p-mTOR蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。相较于模型组，高剂量组、中剂量组、低剂量组新生大鼠脑组织中p-mTOR蛋白的表达水平呈显著升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。

图5 各组新生大鼠脑组织中p-mTOR表达情况

表5 各组新生大鼠脑组织中p-mTOR表达情况比较（x±s）

2.6 各组新生大鼠脑组织中p-S6表达情况比较 见图6，表6。相较于假手术组，模型组新生大鼠脑组织中p-S6蛋白的表达水平显著降低（P＜0.05）。相较于模型组，高剂量组、中剂量组、低剂量组新生大鼠脑组织中p-S6蛋白的表达水平呈显著升高，且呈剂量依赖性（P＜0.05）。

图6 各组新生大鼠脑组织中p-S6表达情况

表6 各组新生大鼠脑组织中p-S6表达情况比较（x±s）

3 讨 论

HIBD的发生机制极其复杂，与氧自由基、神经元自噬、神经元凋亡等密切相关［9］。相关研究指出，大脑发生缺氧缺血早期便可引起细胞凋亡及神经元病理性自噬等［10］。本研究实验显示，与假手术组比较，模型组中幼鼠大脑皮层、海马等区域呈现明显的大面积白色梗死，表明造模成功；高剂量组、中剂量组、低剂量组中脑梗死面积较模型组显著减小，且呈一定的剂量依赖性，表明丹参酮ⅡA能有效改善脑梗死情况。

自噬是降解细胞内蛋白和损伤细胞器，稳定细胞环境的主要方式［11］。相关研究指出，当自噬处于稳态平衡时对机体具有保护作用，但当自噬平衡状态打破时，将导致机体出现损伤［12］。 Lu 等［13］研究中发现，新生大鼠缺血缺氧性脑损伤模型中自噬体数量明显增加，自噬标志蛋白表达水平明显上升，当自噬抑制剂作用于模型可显著降低自噬体数量，抑制神经细胞凋亡，其认为自噬的激活对新生大鼠HIBD具有促进作用。相关研究发现，LC3（微管相关蛋白轻链3）可作为自噬形成标志物，当细胞受到某种刺激，位于细胞内的LC3-Ⅰ将脂质化为LC3-Ⅱ，参与形成自噬体，因此可根据分析LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值是否上调判断自噬体的形成［14］。还有研究证实，Beclin-1为除 LC3外与自噬密切相关的蛋白，主要参与自噬过程启动［15］。本研究结果发现，模型组中观察到皮质神经元中存在大量的自噬体和自噬溶酶体，其中泡状自噬体中包裹有可见的细胞质结构，同时与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组中自噬体数量明显减少，且呈一定的剂量依赖性。同时本研究结果还发现，模型组中LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表达水平较假手术组均显著降低，表明缺氧缺血破坏神经元内稳定环境，造成蛋白错误修饰及细胞器损伤，从而通过上调Beclin-1蛋白表达水平启动自噬，LC3-Ⅰ脂质化，形成自噬体。与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组新生大鼠脑组织中LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表达水平显著下降，且呈剂量依赖性，提示丹参酮ⅡA可通过抑制LC3-Ⅱ/（LC3-Ⅰ+LC3-Ⅱ）的比值和Beclin-1蛋白表达水平，抑制自噬过程。

Akt-mTOR信号转导通路是哺乳动物肿瘤免疫中的重要信号通路，其对调节细胞的生长、增殖、自噬以及凋亡有重要的作用［16］。Akt被相关因子激活磷酸化，发生空间转移，由胞浆转移至细胞核，进而调控下游如mTOR、Caspase-9、cyclin-D1等相应的信号分子，其中mTOR发生磷酸化激活下游p70S6K，促进核糖体蛋白S6发生磷酸化，从而调控细胞自噬，此调节过程与自噬的形成具有负相关性［17］。Makhov等通过荜茇明碱对mTOR信号影响的研究中发现，荜茇明碱能有效抑制细胞中Akt靶蛋白的磷酸化，下调Akt可有效抑制下游mTORC1的活性与细胞自噬［18］。本研究实验发现，与假手术组比较，模型组新生大鼠脑组织中p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白的表达水平均显著降低，提示Akt-mTOR信号转导通路参与调节神经元自噬，且呈负调节作用。与模型组比较，高剂量组、中剂量组、低剂量组新生大鼠脑组织中p-Akt、p-mTOR、p-S6蛋白表达水平均升高，并呈剂量依赖性，提示丹参酮ⅡA对Akt-mTOR信号转导通路具有正调节作用。

综上所述，丹参酮ⅡA对新生大鼠缺血缺氧性脑损伤具有显著的改善作用，大脑皮质神经元自噬受到显著的抑制，推测其机制可能为通过激活Akt-mTOR信号转导通路，抑制神经元自噬，从而改善脑损伤情况。然而，缺血缺氧性脑损伤是一个极其复杂的过程，其具体调节机制还有待进一步研究。