温阳振衰颗粒对心肌细胞损伤模型LncRNA BIC的影响*

蔡虎志 吴治谚 徐则林△ 指导 陈新宇

（1.湖南中医药大学第一附属医院，湖南 长沙 410007；2．广东省江门市五邑中医院，广东 江门529000）

慢性心力衰竭（CHF）是心功能障碍的一种疾病表现，可由多种心血管疾病慢性进展而来，CHF在有基础疾病的中老年人群中发病率较高，且其远期预后较差［1-3］。课题组前期研究证实了MAPK信号通路中的主要亚族P38MAPK通路蛋白的磷酸化表达与CHF病情进展呈密切的正相关［4］，且温阳振衰颗粒可显著下调p38MAPK蛋白磷酸化的表达。作为重要的p38MAPK上游非编码调控基因，LncRNA BIC可通过miR-155/MAP3K10途径调控MKK-3及MKK-6，从而影响p38MAPK介导的系列生物活性反应［5-6］。温阳振衰颗粒是否通过调控LncRNA BIC进而影响p38MAPK介导的心肌细胞损伤过程而起到抑制心肌细胞受损的效果，为验证温阳振衰颗粒的治疗效果和作用机制而设计了本实验研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 盐酸阿霉素由深圳万乐药业有限公司提供（H44024359），SYBR Green PCR 试剂盒购自上海斯信生物科技有限公司（KM4101），温阳振衰颗粒（由附子、干姜、甘草、红参、茯苓、五味子组成，8 g/包）由湖南中医药大学第一附属医院提供（201705）。

1.2 心肌细胞株传代培养 使用H9C2心肌细胞（中乔新舟，ZQ0102），将心肌细胞放入10%FBS含氨基酸和葡萄糖的培养基中，细胞增殖到一定数量后，使用0.25%胰蛋白酶配制单细胞溶液，其余细胞溶液经过稀释后统计细胞数量，并根据现有浓度进行稀释调配，直至合适种板培养浓度。

1.3 含药血清制备 健康SPF级大鼠8只，雌雄各半，体质量200～220 g，由湖南斯莱表达实验动物有限公司提供，许可证号SCXK（湘）2014-002。在自由饮食、光/暗周期为 12 h/12 h（光照时间 6∶00～18∶00）保持噪音（40±10） db，温度（20±3） ℃条件下饲养。 将温阳振衰颗粒溶于蒸馏水中并按照1.44 g/（kg·d）的剂量进行稀释，并将稀释液给大鼠灌胃［7］，每日分2次喂服给大鼠。给药1周后从大鼠腹主动脉取血并进行离心、过滤和分装操作，制备为与做实验分组相同数量的含药血清溶液，并冷藏保存，使用时配置为10%浓度进行实验。

1.4 心肌细胞损伤诱导 根据分组要求，加入阿霉素（ADR），标记为ADR组。培养液中加入ADR的浓度为2.67 μmol/L，培养时间同其他各组［8］。

1.5 分组方法 共使用4块6孔板按4×103进行接种，每组使用一组6孔板，并对4块6孔板进行编号，分别对应正常对照组、正常加含药血清组、ADR组、ADR加含药血清组，共培养44 h。

1.6 检测指标 1）心肌细胞形态学观察：取培养后各组心肌细胞，采用倒置显微镜观察各组心肌细胞形态学变化。2）心肌细胞存活率检测：实验完成后对各组细胞溶液进行处理，每组中加入20 μL/mL的MTT溶液以检测细胞存活情况，具体过程为吸取经过MTT培养后的细胞上清液，加入 DMSO 溶液（Sigma，D2650），将培养板在摇床上低速振荡10 min，使用酶联免疫吸附试验在490 nm出检测各组细胞的吸光值。3）心肌细胞LncRNA BIC基因表达检测：取各组心肌细胞，根据NCBI基因库中LncRNA BIC基因序列进行引物设计，Trizol一步法提取总RNA，在-80℃环境中对提取物进行冷藏。并根据所购PCR试剂盒说明书进行荧光分析，PCR过程中使用的引物情况，见表1。扩增条件：94 ℃、5 s，60 ℃、60 s，72 ℃、2 s，42个循环。 扩增后72℃延伸10 min，反应结束后建立RT-PCR溶解曲线，以06为内参，校正每个样品的ct值，表达差异以2-ΔΔCT表示。

表1 PCR过程中使用的引入情况

1.7 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。计量资料以（x±s）表示。数据资料进行正态分析，符合正态分布的资料录入进行进一步检验，4组组间比较采用单因素方差分析。采用LSD法、Tamhane′T2法进行P值计算。计数资料用例数和百分比（%）描述，组间或组内比较采用χ2检验，等级资料选用Ridit分析。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组心肌细胞形态学观察 见图1。倒置显微镜下可见正常对照组、正常加含药血清组心肌细胞形态、胞质、间质及横纹均为正常；ADR组心肌细胞出现肌纤维的溶解，横纹模糊，及胞浆空包变性，且表现出不同程度的炎症细胞浸润和间质水肿。ADR加含药血清组的心肌细胞较ADR组，其肌纤维溶解、恒温模糊、胞浆空泡变性、炎症细胞浸润、间质水肿等情况均有所改善。

图1 各组心肌细胞形态学观察（100倍）

2.2 各组心肌细胞存活率比较 见表2。正常对照组、正常加含药血清组的细胞存活率相当（P＞0.05）；ADR组、ADR加含药血清组与正常对照组比较，其细胞存活率均明显下降 （P＜0.05）；ADR加含药血清组与ADR组比较，其细胞存活率有所上升（P＜0.05）。

2.3 各组心肌细胞LncRNA BIC的表达比较 见表3，图2。正常加含药血清组与正常组比较，LncRNA BIC表达明显升高 （P＜0.05）；ADR组与正常组比较，LncRNA BIC表达明显降低（P＜0.05）；ADR加含药血清组与ADR组比较，LncRNA BIC表达升高（P＜0.05）。

表2 各组心肌细胞存活率比较（%，x±s）

表3 各组心肌细胞LncRNA BIC的表达比较（%，x±s）

图2 各组心肌细胞LncRNA BIC的表达

3 讨 论

p38MAPK作为机体应激的主要细胞信号传导通路，可以被组织局部神经分泌激素ET、AngⅡ及细胞因子等刺激因素激活，加速心肌细胞的损伤［9-10］。活化后的p38MAPK可以激活多种转录因子，使心肌细胞损伤性基因的表达上调以及细胞应激保护性基因的表达下调。P38MAPK的基因表达和活性增强是引起心肌细胞损伤和进一步加剧心肌功能障碍的重要影响因素［11-12］。LncRNA是一类转录本长度超过200 nt的RNA，该类长链RNA不具有蛋白编码功能，但可以再转录和遗传过程中对编码基因进行调控，从而改变后者的水平［13］，作为P38MAPK的上游调控基因，LncRNA BIC虽然自身不能直接编码蛋白质，但可通过miR-155/MAP3K10途径调控MKK-3及MKK-6，进而直接对P38MAPK的活化产生影响，但LncRNA BIC在慢性心衰或心肌细胞损伤模型中的表达及作用目前罕有文献报道。

温阳振衰颗粒为湖南中医药大学第一附属医院自制中成药，由笔者所在医院陈新宇教授提供配方，在研制成为颗粒剂前其基本组方的汤剂在湖南中医药大学第一附属医院已经应用数年，且疗效肯定。该方由附子、干姜、甘草、红参等多味中药组方而成，其中附子、干姜分补中焦、下焦阳气，对阳气虚衰、阴寒内积的病症疗效甚佳［14-15］。炙甘草进一步提升温阳之性，同时又可调和诸药、补虚和中［16］。根据笔者应用经验，该药在治疗多种类型的心血管疾病中均具有疗效，尤其是各类辨证为心阳不振而表现出的心功能不全症状，同时对于阳虚水泛和水饮凌心而出现的全身或局部水肿也有很好的治疗效果。温阳振衰颗粒中以四逆汤为底方，同时加入多味温补中药提升其温阳之功效，临床应用时保证一定剂量的给药还具有回阳救逆的急救功效。课题组以往研究已经证实温阳振衰颗粒能够有效改善ADR诱导的心肌损伤动物的心功能，缓解心衰症状表现，同时检测到了p38MAPK表达的下降和水平的降低。本实验研究通过分组对比方式进行对照研究，在阿霉素诱导的心肌细胞损伤模型中，LncRNA BIC的表达明显下降，心肌细胞的存活率也相应较低。在使用温阳振衰颗粒含药血清干预后，LncRNA BIC的表达显著上调，心肌细胞的存活率也相应升高。上述实验结果说明，LncRNA BIC的高表达有利于心肌细胞的存活，温阳振衰颗粒有可能通过上调心肌细胞中LncRNA BIC的表达介导了心肌细胞损伤的保护作用，这可能是其治疗慢性心衰的重要机制之一。心肌细胞中的LncRNA BIC可能为研发具有全新靶点的心衰治疗药物提供新的突破点，但药物的疗效机制和对疾病的治疗调控仍是需要深入研究的关键点所在。