电针对功能性消化不良大鼠胃窦AMPKα及mTOR的影响*

唐 雷 徐派的 张红星 康朝霞

（湖北中医药大学，武汉 湖北 430065）

功能性消化不良（FD）是指起源于胃或十二指肠的消化不良症状，表现为早饱感、餐后饱胀不适、上腹灼热感或上腹疼痛，且器质性和代谢性疾病无法解释这些症状［1］。FD患病率为11.5%～29.2%，且在不断上升，严重影响患者的生活及工作［2］。由于FD发病机制复杂，药物治疗存在副作用，且个体差异性明显，近年来应用电针治疗FD的疗效得到大量实验及临床研究支持［3-5］。在以往研究中我们也发现，电针足三里穴可有效地促进消化功能的恢复，并可恢复FD大鼠的血浆胃促生长素（Ghrelin）水平［6］，但 Ghrelin 的调节机制还不清楚。有研究发现大鼠胃黏膜中雷帕霉素靶蛋白（mTOR）与Ghrelin有共定位现象，可以调节食物摄取［7］。还有研究表明大鼠神经、胃肠等组织中的腺苷酸激活蛋白激酶（AMPK）的表达与电针干预作用有关［8］。本研究旨在观察电针足三里对FD大鼠AMPKα及mTOR的影响，初步探讨电针治疗FD的相关机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 选用8～12周龄无特定病原体（SPF）级 SD 大鼠 50 只，体质量（200±20） g，雌雄各 25 只，8～12周龄，购买于湖北实验动物研究中心，动物许可证号：SCXK（鄂）2011-0012。将上述大鼠饲养于湖北中医药大学SPF动物房内，相对湿度50%～70%，室温22℃。适应性喂养1周后开始实验。

1.2 试剂与仪器 主要试剂包括RIPA蛋白裂解缓冲液、BCA蛋白浓度检测试剂盒、Western一抗、二抗稀释液（均购于上海碧云天生物技术有限公司）、AMPKα抗体（sc33524，SANTA 公司）、mTOR 抗体（Ab109268，Abcam 公司）、actin 内参抗体（A20120A0702，BioTNT公司）、 羊抗兔 IgG （PAB150011，Bio-swamp公司）、RNA逆转录试剂盒（639505，TAKAPA公司）等；主要实验仪器包括高速低温离心机（X-22，美国Beckman公司）、全自动检测酶标仪（168-1002XC，美国BIORAD 公司）、Western电泳仪 （Mini-Trans Blot， 美国BIO-RAD公司）、实时荧光定量PCR仪（CFX-96，美国BIO-RAD公司）、无菌针灸针（0.25 mm×10.0 mm，苏州医疗用品有限公司）、韩氏电针仪（HANS-200A，南京济生医疗科技有限公司）等。

1.3 分组与造模 按随机数字表法挑选10只大鼠纳入正常组，余40只大鼠进行造模，14 d后剔除造模未成功大鼠。采用随机数字表法将造模成功大鼠分为模型组及电针组，每组10只。本实验经湖北中医药大学实验动物伦理委员会审核、许可。造模方法参考王煜姣等［9］的方法，采用不规则饮食配合夹尾刺激法，制模大鼠每逢周一、周三、周五禁止摄食、饮水，同时用长海绵钳夹大鼠尾巴末端1/3处，以不破皮但使其尖叫挣扎为度，让大鼠之间相互厮打，每日 2 次（9∶00，16∶00），每次持续30 min，连续刺激14 d。大鼠出现饮水及饮食明显减少，毛发变黄，枯燥无光泽，倦卧活动减少，情绪低落抑郁，容易激惹，提示造模成功。

1.4 干预方法 采用自制鼠衣束缚电针组FD大鼠，并将其悬挂于自制装置上，参照 《大鼠穴位图谱的研制》［10］选取“足三里”穴，用 1寸针灸针针刺 FD 大鼠双侧“足三里”穴，针刺深度为0.3～0.5寸，进针后接通HANS-200A电针仪；设置电针刺激参数如下：疏密波，频率2 Hz/100 Hz，电刺激强度2 mA，每次 30 min，每日1次，共治疗10 d。在电针组进行电针刺激同时，正常组及模型组大鼠也进行束缚固定（同电针组），但不给予针刺及电针干预。

1.5 标本采集与检测 最后一次治疗结束后大鼠禁食24 h，给予腹腔麻醉 （将7%水合氯醛配成0.5 mL/100 g剂量），然后将大鼠固定，剖开腹腔后结扎胃贲门和胃幽门，剪开胃体，清洗胃内容物后拭干，剪取胃窦组织装于EP管中，立即用液氮冻存，最后置于-80℃冰箱中保存待测。1）采用Western blotting法检测大鼠胃窦AMPKα、mTOR蛋白表达。取100 mg胃窦加入1 mL裂解液匀浆，将裂解后的样品在4℃、12 000 g条件下离心15 min，取上清进行蛋白质定量后贮存于-80℃冰箱中。根据待测蛋白的分子量配置SDSPAGE凝胶，然后电泳转膜，封闭1 h孵育一抗4℃过夜，第2天孵育二抗后显影。2）采用qRT-PCR技术检测大鼠胃窦AMPKα、mTOR mRNA表达。从-80℃冰箱中取100 mg胃窦，加入Trizol后研磨，多次离心后提取RNA，然后将RNA逆转录为cDNA，最后进行qRT-PCR扩增。其扩增方法如下：95℃预变性3 min，95℃变性5 s，56℃退火10 s，72℃延伸25 s，共进行40个循环；采用2-△△ct法进行数据分析。

1.6 统计学处理 应用SPSS19.0统计软件。计量资料以（±s）表示，符合正态分布的计量资料组间比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用最小显著差异法（LSD），方差不齐时采用 Dunntt′s T3法，不符合正态分布数据比较采用秩和检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组大鼠一般情况 造模过程中正常组大鼠各项活动均正常，模型组大鼠从第7日开始发现笼内粪便稀拉，可闻到鼠笼内有明显秽臭，第10～14日发现部分大鼠进食、打斗明显减少，毛发暗黄、不柔顺、无光泽，情绪低落萎靡，提示FD大鼠造模成功。与模型组比较，电针组大鼠经电针刺激后，发现大鼠活动增多，进食增加，毛发逐渐恢复光泽、柔顺。

2.2 各组大鼠胃窦组织中AMPKα和mTOR mRNA的表达比较 见表1，图1。与正常组大鼠比较，模型组FD大鼠胃窦中AMPKα mRNA的表达水平明显降低（P＜0.05），mTOR mRNA 的表达水平显著升高（P＜0.05）。与模型组FD大鼠比较，电针组FD大鼠胃窦中AMPKα mRNA的表达水平明显升高 （P＜0.05），mTOR mRNA的表达水平显著降低（P＜0.05）。

表1 各组大鼠胃窦中AMPKα和mTOR mRNA的表达量比较（x±s）

图1 各组大鼠胃窦中AMPKα和mTOR mRNA的表达量

2.3 各组大鼠胃窦中AMPKα和mTOR蛋白的表达比较 见表2，图2。与正常组大鼠比较，模型组FD大鼠胃窦中AMPKα蛋白的表达量显著降低 （P＜0.05），mTOR蛋白的表达量显著升高（P＜0.05）；与模型组FD大鼠比较，电针组FD大鼠胃窦中AMPKα蛋白的表达量明显升高 （P＜0.05），mTOR蛋白的表达显著降低（P＜0.05）。

表2 各组大鼠AMPKα和mTOR蛋白的表达量比较（x±s）

图2 各组大鼠胃窦中AMPKα和mTOR蛋白的表达量

3 讨 论

本研究结果提示，与正常组大鼠比较，模型组FD大鼠毛发暗黄、不柔顺、无光泽，进食、打斗均减少，状态低落萎靡；胃窦组织中AMPKα mRNA以及蛋白表达水平显著降低，mTOR mRNA以及蛋白表达水平显著升高。与模型组比较，电针组FD大鼠毛发逐渐恢复光泽、柔顺，活动及进食量均增加，胃窦组织中AMPKα mRNA以及蛋白水平明显升高，mTOR mRNA以及蛋白表达水平明显降低。

与同类研究比较［11-12］，虽然最终结果均提示电针能调节FD大鼠胃运动功能，但作用机制还是有所区别。王柳等认为电针可能是通过改变大鼠迷走神经背核（DMV）区 N-甲基-D-天冬氨酸受体（NMDAR）活性从而调节血清NO含量并发挥治疗作用［11］。杨云等认为电针足三里改善胃肠功能的作用机制可能为降低FD 大鼠胃窦及血浆中神经降压素（NT）的表达［12］。

Ghrelin是一种重要的胃肠激素，具有控制食欲、增强胃动力等作用，与机体胃肠功能具有高度相关性，在胃肠动力学中的调节机制一直是研究热点。mTOR作为一种高度保守的苏氨酸/丝氨酸蛋白激酶，是Ghrelin的调节因子之一，分子大小为259 kDa，可以感知能量稳态的变化，研究发现多种蛋白的合成、增殖、自噬等过程与它有关，多种细胞的生长及细胞周期进程也与它密不可分［13］。研究还表明胃窦组织中mTOR的变化也会导致Ghrelin表达量的改变，从而影响食物摄取［14］。

AMPK蛋白以异源三聚体复合物的形式存在，分别由不同的基因表达两种亚型：α-亚基和β-亚基。AMPKα作为mTOR的上游调节分子之一，是调节细胞内能量代谢的重要调节因子，广泛存在于骨骼肌、胃肠、胰腺等组织系统中，能够精确地反映细胞能量状态的变化［15-16］。研究发现，电针作为治疗手段，能有效地增加相关疾病模型大鼠的骨骼肌、胃肠、神经等组织中AMPKα的表达［17-18］。还有研究表明活化的AMPKα可以直接磷酸化结节性硬化症复合物（TSC），促进TSC1/2复合物形成，竞争性地抑制mTOR的活性［19］。结合上述分析及本课题研究结果，在电针足三里治疗功能性消化不良的过程中，可能存在基于AMPKα变化而调节mTOR的机制。

FD属于中医学的“胃脘痛”范畴，病机为本虚标实，脾虚为本，气滞、食积、痰湿、血瘀为标。脾为气机之枢，主运化，主升，胃主受纳，主降，脾升胃降才能维持消化道正常运化、受纳、腐熟的功能。足三里穴是足阳明胃经合穴，又为胃的下合穴，能补脾胃，调肠腑，为后天生化之源。《四总穴歌》云“肚腹三里留”。《灵枢·邪气脏腑病形》曰“合治内腑”。《素问·水热穴论》云“气街、三里、巨虚上下廉，此八者以泻胃中之热也”。这些都充分说明了足三里穴善治脾胃病的特点，是胃肠疾病中最常见的取穴。电针是通过各种物理化学方式刺激相关腧穴，从而激发经络之气，促进阴阳协调，达到防治疾病的目的［20］。这也是采用电针足三里穴治疗功能性消化不良的原因。

综合本研究结果来看，电针足三里穴可改善FD大鼠的胃肠消化，增加FD大鼠胃窦AMPKαmRNA以及蛋白的表达水平、降低FD大鼠胃窦mTOR mRNA以及蛋白的表达水平可能是其作用机制之一，但电针是如何影响mTOR和AMPKα、mTOR与AMPKα的相互作用机制等还需进一步行严谨的实验来深入研究。