芹菜素对腺嘌呤所致慢性肾功能衰竭大鼠肾保护作用及机制探索*

杨 杰 胡亚丽 杨晓媛

（河北北方学院附属第一医院，河北 张家口 075000）

慢性肾功能衰竭（CRF）是各种慢性肾脏疾病持续进展的共同结局，呈进行性加重且不可逆，具有预后差、死亡率高的特点［1-2］。目前临床上尚缺乏有效的治疗措施，一直是医药研究者关注的热点。CRF病理机制非常复杂，近年来病理生理学研究发现氧化应激、炎症反应等在CRF发生发展过程中发挥着重要作用［3-4］，为研究新型抗CRF药物研发提供了新的靶点。芹菜素（APG）是一种具有广泛生物学活性的天然存在的黄酮类化合物，在多种水果蔬菜中均含量丰富，现代药理学研究发现APG具有良好的抗氧化和抑制炎症反应的生物学活性［5-7］，但APG是否对CRF具有保护作用尚未见文献报道。本实验将通过复制CRF模型大鼠并腹腔注射给予APG进行治疗，通过相关指标检测并对比正常对照组、CRF模型组实验数据，探讨APG对CRF大鼠肾脏组织的保护作用并探索其机制。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康无特定病原体（SPF级）雄性SD大鼠 （8周龄，220～260 g）购自河北省实验动物中心［SCXK（冀）2013-1-003］。 饲养环境：23～25 ℃、相对湿度 55%～60%，光照周期明∶暗为 12 h∶12 h。

1.2 试药与仪器 APG购自陕西慧科植物开发有限公司（批号 170329）；肾功能指标［血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCr）、尿素（UA）、24 h 尿蛋白（Pro）］检测试剂盒和炎症因子指标［C反应蛋白（CRP）、白细胞介素-1（IL-1）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、可溶性细胞间黏附分子-1（sICAM-1）、血管间黏附分子-1（VCAM-1）］检测试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司；氧化应激监测指标［超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、晚期氧化蛋白产物（AOPPs）、总抗氧化能力（T-AOC）］ 试剂盒购自南京建成生物工程研究所。BS-200型全自动生化分析仪 （深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；CUT4062型石蜡切片机（德国SLEE公司）；iMark型酶标仪（美国 Bio-Rad公司）；倒置光学显微镜（日本Olympus公司）；台式离心机（深圳市赛泰克生物科技有限公司）。

1.3 分组与造模 取100只实验用大鼠按照随机数字表法随机分为正常对照组、模型组、APG低剂量组［10 mg/（kg·d）］、APG 中剂量组［20 mg/（kg·d）］、APG 高剂量组［40 mg/（kg·d）］组，每组 20 只。 复制CRF大鼠模型［8］：制备25%腺嘌呤溶液，连续灌胃21 d［250 mg/（kg·d）］以制备 CRF 大鼠模型。 造模结局判断［9］：SCr水平高于正常高值，肾脏组织呈现炎性细胞浸润、肾间质纤维化等病理性改变，即造模成功。

1.4 干预方法 准确称量APG并加入适量0.9%氯化钠注射液，以配置浓度为20 mg/mL的APG溶液，然后依次稀释配置浓度为10 mg/mL、5 mg/mL的APG溶液。造模完成后，APG低、中、高剂量组分别腹腔注射给予浓度为 5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL的APG溶液（2 mL/kg）［10-11］，每日 1 次，疗程 28 d；正常对照组和模型组同步腹腔注射给予等体积的0.9%氯化钠注射液（2 mL/kg）。

1.5 标本采集与检测 疗程结束后，腹腔注射乌拉坦实施麻醉，开腹经腹主动脉取血，不做抗凝处理，静置1 h，4℃低温1 500 r/min离心10 min取血清，血液标本均-20℃保存待检。取血完成后，摘取两侧肾脏组织，分别用于称质量、计算肾脏指数，病理学检查和肾脏组织生化指标检测。1）肾功能指标检测：治疗满疗程后，收集24 h尿量并测定Pro；通过全自动生化分析仪测定血清中BUN、SCr、UA含量。2）称量体质量、肾脏重量并计算肾脏指数。称量体质量和左侧肾脏质量。计算公式：肾脏指数=左侧肾脏重量/体质量。3）组织病理学检查及评分：取称质量后左侧肾脏组织，置4%多聚甲醛溶液进行固定，72 h后进行石蜡包埋和切片，脱蜡水化处理后行常规HE染色 （依次进行酒精梯度脱蜡、PBS洗涤、苏木素染色5 min、0.5%酒精盐酸分色、尹红染色20 s、封片等步骤），通过光学显微镜观察肾脏组织形态。 对肾脏组织病变进行评分［12］：（1）肾小球病变评分。0分为结构正常；1分为少数肾小球变大或缩小；2分为部分肾小球变大或缩小；3分为大多数肾小球变大或缩小，或出现玻璃样变。（2）肾小管病变。0分为结构正常；1分为少量近曲小管细胞空泡变性；2分为部分近曲小管细胞空泡变性；3分为大量近曲小管细胞空泡变性。（3）肾间质病变。0分：结构正常。1分：肾小管轻度萎缩。2分：肾小管中度萎缩。3分：肾小管重度萎缩。（4）炎性病变。0分为结构正常；1分为小灶状炎症；2分为片状炎细胞浸润，个别肾小管坏死；3分为大片炎细胞浸润，少量肾组织坏死。病变积分=∑各部位病变评分。4）氧化应激监测指标测定：取右侧肾脏组织经冷裂解液裂解、匀浆和低温3 000 r/min离心10 min处理后，取上清液，遵照各试剂盒说明书通过酶标仪测定抗氧化酶SOD、CAT活性和MDA含量；采用化学比色法，通过酶标仪测定血清中T-AOC和AOPPs水平。5）炎症细胞因子测定：遵照各试剂盒说明书通过酶标仪测定血清中 CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1 含量。

1.6 统计学处理 应用SPSS15.0统计软件。计量资料以（x±s）表示，组间均数比较采用单因素方法分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 各组肾功能指标检测比较 见表1。模型组大鼠血清BUN、SCr、UA含量和Pro较正常对照组均显著升高（P＜0.01）；较模型组，治疗 28 d后 APG中、高剂量组CRF大鼠血清BUN、SCr、UA含量和Pro均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05或P＜0.01）。

表1 各组肾功能指标检测结果比较（x±s）

2.2 各组体质量、左侧肾脏质量和肾脏指数比较 见表2。模型组大鼠体质量较正常对照组显著降低且左侧肾脏质量、肾脏指数显著升高（P＜0.01）；较模型组，APG高剂量组治疗28 d后CRF大鼠体质量升高 （P＜0.05），APG中、高剂量组左侧肾脏质量、肾脏指数显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表2 各组体质量、左侧肾脏质量和肾脏指数比较（x±s）

2.3 各组肾脏组织病理学检查结果比较 见图1。正常对照组大鼠肾脏组织结构和细胞形态均未见异常；与正常对照组比较，模型组大鼠肾脏组织呈现明显的病理性改变，主要表现为肾小球数量减少、球囊粘连、囊腔扩大，肾小管坏死、大量炎症细胞出现、中性粒细胞浸润等；较模型组，APG中、高剂量组治疗28 d后CRF大鼠肾脏组织病变明显改善，改善效果以高剂量组最为显著。计算并统计分析各组大鼠肾脏组织病变评分：模型组大鼠肾脏组织病变评分（9.45±0.61）分，较正常对照组（0.68±0.27）分显著升高（P＜0.01）。APG低、中、高剂量组肾脏组织病变评分分别为（8.26±0.80）分、（6.69±0.57）分、（5.94±0.52）分，较模型组，APG 中、高剂量组治疗28 d后CRF大鼠肾脏组织病变评分显著降低（P＜0.01）。

图1 肾脏组织病理学检查结果（HE染色，400倍）

2.4 各组肾脏组织氧化应激指标比较 见表3。模型组大鼠肾脏组织抗氧化酶SOD、CAT活性较正常对照组显著降低且MDA含量升高（P＜0.01）；较模型组，APG中、高剂量组治疗28 d后CRF大鼠肾脏组织SOD、CAT活性显著提高且MDA含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01）。

表3 各组肾脏组织氧化应激指标比较（x±s）

2.5 各组血清氧化应激指标比较 见表4。模型组大鼠AOPPs水平较正常对照组显著升高（P＜0.01），T-AOC水平显著降低（P＜0.01）；较模型组，APG中、高剂量组治疗28 d后CRF大鼠血清AOPPs水平显著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中高剂量组T-AOC水平显著升高（P＜0.05）。

表4 各组血清氧化应激指标比较（x±s）

2.6 各组炎症细胞因子含量比较 见表5。模型组大鼠血清炎症细胞因子 CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量较正常对照组显著升高（P＜0.01）；较模型组，APG 中、高剂量组 CRP、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1含量显著降低（P＜0.05或P＜0.01），其中高剂量组IL-1含量降低（P＜0.01）。

表5 各组炎症细胞因子含量比较（x±s）

3 讨 论

流行病调查发现CRF发病率达568/100万，具有不可逆及持续进展的特点，是主要致死原因之一［13］，是临床上亟待解决的医学难题之一。高浓度腺嘌呤持续摄入是常用的CRF大鼠模型造模方法［9］，该方法制作的CRF大鼠模型与人类接近。本实验设置正常对照组、模型组和芹菜素（APG）低剂量组［10 mg/（kg·d）］、中剂量组［20 mg/（kg·d）］和高剂量组［40 mg/（kg·d）］，因CRF判定指标较为明确且本实验旨在考察APG对CRF的影响并探讨其可能的机制，因此未设置阳性对照组，不会对结论造成影响。本实验结果显示，经APG治疗28 d能够有效减少CRF大鼠排尿量并降低24 h尿量和Pro，降低血清BUN、SCr、UA含量，抑制CRF大鼠肾脏组织病变，降低肾脏指数，并且各组CRF大鼠各监测指标改善程度与APG给药剂量具有相关性，提示APG对CRF大鼠肾脏损伤和肾功能具有一定的剂量依赖性保护作用。

既往研究发现氧化应激、炎症反应等在CRF发生发展过程中发挥着重要作用［3-4］。活性氧自由基（ROS）代谢失衡而蓄积是引发氧化应激损伤的主要原因，其与抗氧化酶活性降低密切相关。肾脏组织含有丰富的抗氧化酶SOD和CAT，二者活性降低将导致肾脏组织内ROS的大量蓄积而引发肾脏组织过氧化损伤，MDA即为过氧化产物［14］。血清T-AOC水平能够反应机体整体抗氧化能力；血清中AOPPs是一种氧化修饰蛋白，是常用的氧化应激标志物［15］，并且Witko-Sarat V等［16］研究发现AOPPs能够介导机体炎症反应。血清CRP、IL-1、IL-6、TNF-α 是常用的机体炎症监测指标，此外王兴红等研究发现血清sICAM-1、VCAM-1含量水平与炎性细胞浸润密切相关［17］。本实验研究发现，经APG治疗28 d能够有效提高CRF大鼠肾脏组织SOD、CAT活性并降低MDA含量，提高血清T-AOC水平并降低AOPPs水平，降低CRF大鼠血清炎症细胞因子 CRP、IL-1、IL-6、TNF-α、sICAM-1、VCAM-1 含量，APG高剂量组各指标改善程度优于APG中、低剂量组。结果提示APG具有抑制CRF大鼠氧化应激损伤和炎症反应的药理学作用，且该药理作用具有一定的剂量依赖性。

综上所述，APG对CRF大鼠肾组织具有一定的剂量依赖性保护作用，APG降低氧化应激损伤、抑制炎症反应可能是该作用的机制。