外泌体在膀胱癌中的应用和研究进展

陈晓榕 王海峰 左毅刚

在全球范围内，膀胱癌的发病率在所有恶性肿瘤中位居第9位，约20%～30%的患者在初次就诊时即被诊断为肌层浸润性膀胱癌(muscle invasive bladder cancer, MIBC)，即使初次诊断为非肌层浸润性膀胱癌(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)也有10%～30%的患者进展为MIBC[1]。2015年，中国膀胱癌仅在男性患者中的全年新发病例约为6.2万例，发病率为8.83/10万[2]。目前诊断和监测膀胱癌的主要手段依然是膀胱镜检查和活检，但膀胱镜作为一种侵入性检查，在膀胱癌的监测上比较费力、耗时，所以急需一种简便和敏感性、特异度均较高的检测方法来诊断、监测膀胱癌的复发和进展。自2007年Valadi等[3]阐述了外泌体在细胞间遗传物质交流中发挥的重要作用并引发众多学者的兴趣后，国内外学界也掀起一股研究外泌体的热潮。随后，大量的研究表明了外泌体在肿瘤的生长、发展、诊断及治疗方面具有重要意义[4-7]。本文将重点阐述外泌体在膀胱癌诊疗中的应用及研究进展。

一、外泌体

外泌体是由正常细胞或肿瘤细胞自分泌、旁分泌及内分泌的一种直径约30～100 nm的胞外囊泡，并由磷脂双分子层特异性地将蛋白质、微小RNA(microRNA, miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)等物质包裹其内，可稳定存在于体液中。外泌体不仅可作为“垃圾袋”将亲代细胞内无用或多余的细胞成分转移至细胞外，也可作为信使在细胞间进行信息传递。

1.外泌体的包埋作用：虽然我们已经知道外泌体中含有大量的蛋白质、遗传物质等，但这些物质被包裹到外泌体中的机制尚未被明确。Villarroya-Beltri等[8]将人类原始T细胞提取的外泌体分别与不同涂层的链霉亲和素珠，包括生物素化的外泌体miRNA(miRNA-198)涂层、生物素化的胞浆miRNA(miRNA-17)及阴性对照(poly-A)涂层或无涂层的链霉亲和素珠，进行共同培养，然后通过质谱分析法、免疫沉淀、qPCR、电泳迁移率改变试验等方法，证明了一种普遍存在的RNA结合蛋白——不均一型核糖核蛋白A2B1(heterogeneous nuclear ribonucleoprotein A2B1, hnRNPA2B1)在外泌体中泛素化后与miRNA-198中的GGAG/CCCU序列特异性结合，可介导miRNA-198主动进行外泌体包埋，这种作用可能取决于hnRNPA2B1和细胞骨架成分相互作用的能力。同时将GGAG/CCCU序列进行突变，发现miR-198与hnRNPA2B1结合被抑制。此外Santangelo等[9]也发现另一种RNA结合蛋白——突触素结合细胞质RNA作用蛋白(synaptotagmin-binding cytoplasmic RNA-interacting protein, SYNCRIP)通过与表达特异性短序列——hEXO序列的miRNA相结合，能够介导miRNA在外泌体中的包埋作用，且将hEXO序列植入其他miRNA中以增强其在外泌体中的表达水平。以上试验都说明了外泌体的内含物并不是被随机分配，而是通过某些确切的分子机制进行包埋的。

2.外泌体与受体细胞的作用方式：外泌体由亲代细胞分泌后可通过以下方式靶向地与受体细胞相结合：①外泌体被受体细胞膜完全内吞，将囊泡内物质传递至受体细胞中，包括脂质筏介导、网格蛋白介导和网格蛋白非依赖性内吞作用[10-11]。②外泌体表面的跨膜蛋白(如PGRL、LAMP1、LAMP2等)与受体细胞相应受体直接接触，进行细胞内信号转导。③外泌体与受体细胞膜直接接触，通过质膜融合的方式将外泌体内物质转移至细胞内[11]。上述作用方式都说明了外泌体内的物质并不是黏附于细胞表面而是被肿瘤细胞摄取的。这与Franzen等[12]以PKH-26标记外泌体后与膀胱癌细胞共培养，通过IDEAS软件对PKH-26的荧光强度和PKH-26+点数测定的结果是一致的。

二、外泌体与膀胱肿瘤微环境

到目前为止，大量的研究已经证明外泌体与肿瘤细胞或周围正常组织细胞之间存在信息交流，这在肿瘤的发生和发展中具有重要意义。Zheng等[13]首次证实了正常细胞分泌的外泌体中磷酸酶和张力蛋白同源基因同源物假基因1(phosphatase and tensin homolog pseudogene 1, PTENP1)减少可促进膀胱癌细胞的增殖和转移，提示正常组织细胞与膀胱癌细胞间存在信息交流。同样在Park等[4]的研究中，体外培养膀胱肿瘤T24系细胞后通过超速离心提取外泌体，再分别比较经磷酸盐缓冲液(phosphate buffer, PBS)处理和提取的外泌体处理后的淋巴管内皮细胞(lymphatic endothelial cells, LECs)的增殖和转移情况，发现外泌体可增强LECs的增殖和转移(P<0.05)，且LECs分泌的外泌体也具有吸引膀胱癌细胞并诱导其转移的作用。Ringuette等[14]的研究表明膀胱癌源性的外泌体可以通过激活TGFβ/SMAD信号通路使正常的膀胱成纤维细胞转变为癌症相关性成纤维细胞，从而促进膀胱癌细胞的侵袭和转移。

除外泌体与周围组织细胞的信息交流可导致肿瘤增殖、转移外，还有研究发现膀胱癌源性外泌体可通过增强上皮细胞-间充质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)，从而达到促进肿瘤发生、发展的效应。Xue等[15]在正常或缺氧条件下分离出高表达lncRNA-UCA1的膀胱癌5637系细胞源性外泌体后，与低表达lncRNA-UCA1的膀胱癌UMUC2系细胞共同培养，并通过透射电镜、纳米颗粒追踪和蛋白印迹分析进行鉴定，评估细胞的增殖、迁移和侵袭能力，结果发现在低氧状态下的5637系细胞产生的外泌体中lncRNA-UCA1表达明显升高，并通过EMT促进UMUC2系膀胱癌细胞的生长和进展。Franzen等[16]通过超速离心的方法从浸润性膀胱癌T24或UMUC3系细胞培养液或是直接从患者的尿液中提取外泌体，然后将其与尿路上皮细胞共同培养，通过评估其EMT水平后发现，相比于PBS处理后的尿路上皮细胞，经膀胱癌外泌体处理后的尿路上皮细胞所表达的间质细胞标志物(包括α-平滑肌动蛋白、S100A4等)明显上调。

三、外泌体内含物与膀胱癌的诊断

作为标志物应具有易分离、易获取、敏感度及特异性高等特点。外泌体广泛存在于人的体液中，如血液、尿液等，可通过相对无创的方法获取，且相较于裸露在细胞外液中的miRNA、lncRNA等物质而言，外泌体具有脂质双层膜结构，能在4 ℃或-20 ℃过夜储存的条件下不影响外泌体的摄取[17]，这说明外泌体可稳定存在于体液中。Baumgart等[18]通过比较不同侵袭力的膀胱尿路上皮癌细胞系及其外泌体的miRNAs表达，首次阐明了外泌体内的分子含量与亲代细胞是部分相似的，这为外泌体作为膀胱癌的诊断标志物提供了理论基础。

1.蛋白质：Chen等[19]识别了2 964种存在于人类尿液外泌体中的蛋白，其中107种被选做候选标志物，并采用液相-二级质谱联用法对膀胱癌患者(n=28)和疝气患者(n=12)的尿液标本中的29种蛋白进行精确定量，其中有24种蛋白的表达在二者之间有显著差异(P<0.05)。随后用酶联免疫法证实了TACSTD2在膀胱癌患者中的表达比疝气患者高出2.1～3.9倍，在阈值为 2.47 ng/ml时，其敏感度和特异性分别为73.6%和76.5%，且在不同级别膀胱癌患者中的表达也有差异(P=0.014)。 Silvers等[20]获取正常尿路上皮组织(n=9)、Tcis(n=13)、不包括Tcis的NMIBC(n=15)、MIBC(n=13)分泌的外泌体，并分析其蛋白的表达，发现S100A4、HEXB、SND1及TALDO1在膀胱癌患者尿液外泌体中的水平具有显著差异(P<0.05)。其中MIBC细胞质中TALDO1的比例显著下降，且与肿瘤特异性生存率呈正相关(P=0.008)。Tsumura等[21]分别检测不同分期的膀胱尿路上皮癌患者(n=52)和健康对照组患者(n=28)术前血清中尿蛋白Ⅲ水平，结果显示膀胱癌患者的尿蛋白Ⅲ水平与对照组相比明显升高(P<0.05)，且其升高水平与肌层浸润程度、病理分级、淋巴血管侵犯呈正相关(P<0.02)。这一系列研究说明外泌体的蛋白质表达在膀胱癌患者中具有显著的特异性，因此通过对外泌体蛋白质表达的评估可以帮助我们在临床上区别膀胱癌患者与健康人，甚至是区分膀胱癌的分级、分期。

2.miRNA：Baumgart等采用基因芯片技术证实在MIBC与NMIBC细胞分泌的外泌体中，7种miRNA包括 miR-141-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p、miR-200c-3p、miR-205-5p、miR-224-5p和miR-429-3p表现出下调的趋势，而另外2种miRNA包括miR-99a-5p、miR-137-3p则呈上调趋势。Andreu等[22]分别提取健康人、低级别膀胱癌和高级别膀胱癌患者尿液外泌体，用RT-qPCR技术检测let-7c、miR-30c-2、miR-146a-5p、miR-194-5p和miR-375的表达水平，结果显示miR-375在高级别膀胱癌患者外泌体中明显下调(P=0.03)，而miR-146a则在低级别膀胱癌患者中呈上调趋势(P=0.03)。以上实验说明在不同级别的膀胱癌患者中miRNA的表达水平是有差异的，同时，也提示可以通过尿液外泌体miRNA定量分析对膀胱癌患者进行分期、分级，并调整治疗方案。事实上单个的miRNA表达异常可能对膀胱癌的诊断存在偏差，这时可以考虑联合多个miRNA指标达到更高的诊断效能。如Miah等[23]分别对膀胱癌患者(n=68)和与其年龄相匹配的对照组(n=53)中的15种miRNA进行调查，发现miR-1224-3p在诊断膀胱癌方面的特异性为83%，敏感度为77%，联合miR-15b、miR-135b和miR-1224-3p的诊断敏感度可达到94.1%。Hanke等[24]则提出尿液外泌体中miR-126与miR-152 的比值在膀胱癌诊断中的特异性为82%，敏感度为72%。

3.lncRNA：Berrondo等[25]对膀胱尿路上皮癌患者(n=10)和健康对照组患者(n=7)进行lncRNA测序后，发现包括HYMA1、LINC00477、 LOC100506688和OTX2-AS1在内的4种lncRNA在高级别膀胱癌患者外泌体中的表达明显上调。Yan等[26]通过对110例Ta/T1期膀胱癌组织及其邻近的正常组织HOX转录反义RNA(HOX transcript antisense RNA, HOTAIR)表达的检测，发现HOTAIR高表达与膀胱癌的高复发率密切相关，这与Berrondo等敲除HOTAIR可减少肿瘤细胞的转移和浸润的结论一致。因此HOTAIR(HR=4.712，95%CI=2.894～8.714，P<0.001)可作为膀胱癌独立的复发预测因子。Zheng等分别提取膀胱癌患者和健康对照组患者血清外泌体，通过受试者工作特征曲线分析得出PTENP1的表达水平对诊断膀胱癌的敏感度和特异性分别为65.4%和84.2%，且与病理分级呈负相关(P<0.05)，并证实PTENP1可拮抗miRNA-17以减少PTEN表达的效应。Zhan等[6]采用受试者工作特征曲线分别对实验组(n=208)和验证组(n=160)共368个尿液样本进行8种候选lncRNA表达的分析，发现联合MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT1 3种lncRNA对两组膀胱癌患者诊断的曲线下面积(AUC)分别为0.854和0.813，均高于尿液细胞学检测(AUC=0.619)。MALAT1、PCAT-1和SPRY4-IT13在膀胱癌患者中的表达明显上调，其诊断敏感度和特异性分别为72.1%和84.6%、72.1%和81.7%、66.3%和76.9%。Kaplan-Meier分析表明PCAT-1(P<0.001)和MALAT1的表达与NMIBC患者的无复发生存率呈负相关(P=0.002)。

四、外泌体与膀胱癌的治疗

基于外泌体可在细胞间进行信息交流的特点，学者们进行了大量以外泌体作为载体传递药物的研究，并取得了良好的抑制肿瘤细胞增殖的效果。Greco等[27]从人胚胎肾293细胞(HEK293)和间充质干细胞提取出外泌体，并通过电穿孔的方法将PLK-1小干扰RNA(small interfering, siRNA)和对照siRNA加载到外泌体中，并与膀胱癌UMUC3系细胞和正常上皮细胞共培养，在48 h后观察到UMUC3系细胞在与加载了PLK-1 siRNA 外泌体共培养后增殖程度明显降低(P<0.01)。Ha等[28]提出以人体自身细胞分泌的外泌体作为siRNA的载体可以避免巨噬细胞和溶酶体的吞噬作用，引发的免疫排斥反应较小的观点，更进一步地为外泌体的靶向治疗提供了理论基础。还有其他将治疗药物装载到外泌体中或将外泌体制成疫苗等方式也可作为抗肿瘤靶向治疗的方法，甚至有研究表明这样可以减少药物的剂量，对正常细胞产生更少的毒性作用[29]。Kumari等[30]则发现了一种在胞质中的蛋白NF2，其表达程度在外泌体的形成中起着重要作用，贝伐单抗可通过抑制NF2介导外泌体生成的作用来阻断蛋白与蛋白之间的相互作用，从而达到抑制膀胱癌发生、发展的效应。Viaud等[31]发现用IF-γ处理后的单核细胞来源的树突细胞分泌的树突细胞源性外泌体(Dex)与未成熟树突细胞分泌的外泌体相比，表达了更高水平的CD40、CD80、CD86等分子，这使得IF-γ-Dex具有更强的免疫原性，能够刺激免疫系统产生更强的免疫应答，从而清除肿瘤细胞。目前这种IF-γ-Dex疫苗已进入大规模制作的Ⅱ期试验。事实上基于外泌体特异性包埋、与受体细胞的作用方式及与肿瘤微环境之间的信息交流等特点，我们也可以通过调节上述过程使外泌体在肿瘤靶向治疗中获得满意疗效。

五、展望

随着越来越多的研究证明外泌体在肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用，基于外泌体性能的肿瘤诊断和治疗方法也逐渐受到大家的广泛关注，相信在未来研究领域中，不同细胞来源外泌体的分泌机制和生理功能，以及如何控制外泌体的成分表达从而提高外泌体的抗肿瘤效应[32]的一系列研究将成为膀胱癌研究领域的一大热点。然而，现有的技术方法所提取出的外泌体纯度不够、破坏了外泌体的结构或内在成分，且提取成本过于昂贵[33]，因此限制了外泌体在临床上的应用。相信经过多学科的合作，进行大样本的临床试验后，我们可以将外泌体正式推进临床医生的视野里，也为膀胱癌患者提供更便捷、更经济、更准确的诊疗方法。